Джардия унике эчәклеге - паразитик организм, ул гиардиазны китерә, эчәк инфекциясе аеруча кечкенә балаларда эч китү клиник билгеләре.Элегерәк без хәбәр иткән идек, күзәнәктән тыш Г. дуэденалис күзәнәкләр эчендәге олигомеризация сыман рецептор 3 (NLRP3) активлаштыра, нуклеотидларны бәйли һәм күзәнәктән тыш весикула (ЕВ) секрециясе аша ялкынсыну реакцияләрен көйли.Ләкин, бу процесста катнашкан патоген белән бәйле унике эчәклек (GEV) төгәл молекуляр үрнәкләр һәм гиардиазда NLRP3 ялкынсыну роле аңлатылырга тиеш.
Рекомбинант эукариотик экспресс плазмидлары pcDNA3.1 (+) - GEVдагы альфа-2 һәм альфа-7.3 гиардиннар төзелде, тычканның төп перитональ макрофагларына күчерелде һәм ялкынсыну максаты молекуласы каспаз-1 үлчәп ачыкланды.P20 экспрессия дәрәҗәсе күрсәтелде..Г. дуоденалис Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары башта NLRP3 ялкынсыну үлчәве белән ачыкланган (NLRP3, про-интерлеукин-1 бета [IL-1β], про-каспаз-1 һәм каспаз-1 p20), IL секрециясе.1β дәрәҗәләр, апоптотик тапланган протеин (ASC) олигомеризация дәрәҗәсе, һәм NLRP3 һәм ASC иммунофлюорсент локализациясе.Г. унике эчәклекнең патогенитетында NLRP3 ялкынсыну роле тычканнар ярдәмендә бәяләнде, аларда NLRP3 активлашуы блокланган (NLRP3 тычканнар) һәм тән авырлыгының патологик үзгәреше, унике эчәк паразитик йөк һәм унике эчәк тукымасы күзәтелде.Моннан тыш, без алфа-2 һәм альфа-7.3 гиардиннары NLRP3 ялкынсыну аша вивода IL-1β сигресын җибәрәме-юкмы икәнлеген тикшердек һәм тычканнарда Г. дуоденалисының патогенитетында бу молекулаларның ролен билгеләдек.
Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары NLRP3 витродагы ялкынсынуны активлаштыралар.Бу p20 каспаз-1нең активлашуына, NLRP3, про-IL-1β һәм про-каспаз-1 белгечләренең экспрессив дәрәҗәләренең үсүенә, IL-1β секрециясенең сизелерлек артуына, ASA тапларының барлыкка килүенә китерде. цитоплазма, һәм ASA олигомеризация индукциясе.NLRP3 ялкынсыну Пениле югалту тычканнардагы Г. унике эчәклекнең патогенлыгын көчәйтә.КЛС белән эшкәртелгән тычканнар NLRP3 блоклы тычканнардан трофозоитларның күбәюен һәм унике эчәк вилласына зур зыян китерүен күрсәттеләр, некротик криптлар белән кысылган һәм ботакланган.Vivo экспериментлары күрсәткәнчә, гиардиннар Альфа-2 һәм Альфа-7.3 NLRP3 ялкынсыну аша IL-1β сигресын китерә ала, һәм альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары белән иммунизация тычканнарда Г. дуоденалисының патогенлыгын киметте.
Бергә тупланган бу тикшеренү нәтиҗәләре шуны күрсәтә: гиардия Альфа-2 һәм Альфа-7.3 хуҗа NLRP3 ялкынсынуына китерә һәм гиардиазны профилактикалау өчен өметле тычканнарда Г.
Джардия унике эчәк - күзәнәктән тыш протозоан паразиты, ул кечкенә эчәклектә яши һәм ел саен 280 миллион гиардиаз авыруы китереп чыгара, аеруча үсүче илләрдәге кечкенә балалар арасында [1].Кешеләр эчә торган су яки М. унике эчәк кистасы белән пычранган ризык белән зарарланалар, аннары ашказаны эченә керәләр һәм ашказаны сокларында чыгаралар.Джардия унике эчәк тропозоитлары унике эчәк эпителиягә бәйләнә, йөрәк төшү, кусау, эч китү, карын авыртуы һәм авырлыкны киметә.Иммунофицитлы һәм кистик фиброзлы кешеләр инфекциягә бирелергә мөмкин.Инфекция шулай ук ​​авыз һәм анал секс аша булырга мөмкин [2].Метронидазол, тинидазол, нитазоксанид кебек препаратлар унике эчәк инфекциясен дәвалауның өстенлекле вариантлары [3].Ләкин, бу химиотерапия препаратлары күңел төшү, карсиногенез һәм генотоксикит кебек тискәре йогынты ясыйлар.Шуңа күрә, G. duodenalis инфекциясен булдырмас өчен, тагын да эффектив стратегияләр эшләргә кирәк.
Инфламмасомалар - тумыштан килгән иммун реакциянең өлеше булган цитосолик протеин комплекслары классы, патоген һөҗүменнән сакларга һәм ялкынсыну реакцияләрен арадашларга булышалар [5].Бу ялкынсынулар арасында нуклеотид бәйләүче олигомеризация (NOD) рецепторы 3 (NLRP3) нуклеотид бәйләүче олигомеризация (NLRP3) нуклеотид бәйләүче охшаш ялкынсыну киң өйрәнелгән, чөнки аны төрле патоген / зарарлы молекуляр үрнәкләр ачыклый ала (PAMP / DAMP), тумыштан килгән иммун системасын таный, активлаштыра.һәм бик күп ялкынсыну авыруларында эчәк гомостазын көйли [6,7,8].Ул үрнәк тану рецепторы (PRR) NLRP3, адаптер апоптотик тапланган аксым (ASC), һәм проспаспаз-1 яки прокаспаз-11 эффекторыннан тора.NLRP3 ялкынсыну патоген һөҗүменә каршы хуҗа булып тора, Неоспора канинумында [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], һәм Лейшмания тикшеренүләрендә.[11], ләкин шулай ук ​​хәбәр ителде, NLRP3 ялкынсыну активлашуы саклагыч иммун реакцияләрне чикли һәм авыру үсешен көчәйтә, мәсәлән, кортларда [12].Элекке ачышларыбызга нигезләнеп, без күзәнәктән тыш Г. дуоденалисының NLRP3 ялкынсынуының күзәнәкләр эчендә активлашуы турында хәбәр иттек һәм күзәнәктән тыш весикулаларны (ЕВ) яшереп, ялкынсыну реакцияләрен модульләштерәбез [13].Шулай да, V duodenalis инфекциясендә NLRP3 ялкынсынуының роле билгеле булырга тиеш.
Гиардиннар башта Г. duodenalis цитоскелетонының структур компонентлары итеп тасвирланганнар һәм трофозоит хәрәкәтендә һәм кечкенә эчәклектә эпителий күзәнәк бәйләнешендә мөһим роль уйныйлар.Әйләнә-тирә мохиткә яхшырак яраклашу һәм аларның патогенлыгын арттыру өчен, Г. дуоденалис трофозоитлары 8 флагелла, 1 урта тән һәм 1 вентраль дисктан торган уникаль циткелет структурасын эшләделәр [14].Джардия унике эчәк трофозоитлары үзләренең цитоскелетонын кулланалар, өске кечкенә эчәккә, аеруча унике эчәклеккә үтеп керәләр, һәм энтероцитларга бәйләнәләр.Алар гел күченәләр һәм күзәнәкләр алмашын кулланып эпителия күзәнәкләренә бәйләнәләр.Шуңа күрә аларның циткелетон белән вируслылыгы арасында тыгыз бәйләнеш бар.Джардия унике эчәклеге өчен хас булган гиардиннар цитоскелетон структурасы компонентлары булып торалар һәм дүрт класска бүленәләр: α-, β-, γ-, һәм δ-гиардиналар.--Гиардиннар гаиләсенең 21 әгъзасы бар, аларның барысы да фосфолипидларны бәйләү өчен кальцийга бәйле сәләткә ия [16].Алар шулай ук ​​цитоскелетонны күзәнәк мембранасына тоташтыралар.Г. duodenalis аркасында килеп чыккан эч авыруы булган кешеләрдә α-гиардиннар инфекция вакытында югары чагылыш таба һәм иммунорактив булалар [17].Джардия Альфа-1 нигезендәге гетерологик вакциналар тычканнардагы гиардиаздан сакланган һәм вакцина үсеше өчен потенциаль кандидат антигеннары булып торалар [18].Альфа-8 гиардин, плазма мембранасында һәм флагеллада локальләштерелгән, ләкин вентраль дискта түгел, Г. дуоденалисында трофозоитларның хәрәкәтчәнлеген һәм үсеш темпын көчәйтә [19].Альфа-14 гиардин флагелладагы микротубул структураларына бәйләнә һәм Г. duodenalis яшәешенә тәэсир итә [20].Альфа-11 гиардины гомер циклында бик күп, һәм Альфа-11 гиардинының чиктән тыш кысылуы Г. дуоденалисның үзенә зыян китерә [21].Ләкин, Альфа-2 гиардины һәм Альфа-7.3 гиардины Г. дуоденалис инфекциясеннән һәм аларның төп механизмнарыннан саклыймы, билгеле түгел.
Бу тикшеренүдә рекомбинант эукариотик экспресс плазмидлар pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 гиардин һәм pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 гиардин NLRP3 хуҗасын активлаштыру өчен тычканның төп перитональ макрофагларына күчерелде.Аннан соң ялкынлы максатлар тикшерелде.Без шулай ук ​​G duodenalis патогенитетында NLRP3 ялкынсыну ролен бәяләдек, Альфа-2 һәм Альфа-7,3 гиардиннар NLRP3 ялкынсыну активлыгын активлаштырамы, тикшердек, һәм гиардиннарның бу ике ролен патогенитетта билгеләдек. G. duodenalis.Безнең уртак максат - Г. унике эчәк инфекциясен профилактикалау өчен перспективалы максатлар эшләү иде.
Кыргый тип (WT) C57BL / 5-8 атнадагы 6 хатын-кыз тычканнары Ляонин Чаншэнг эксперименталь хайваннар үзәгеннән (Ляонин, Китай) сатып алынган.Тычканнар суга бушлай керә алганнар, стерилизацияләнгән ризык алганнар һәм 12/12 сәгать яктылык / караңгы циклда сакланганнар.Инфекциягә кадәр тычканнар ампициллин (1 мг / мл), ванкомицин (1 мг / мл), һәм неомицин (1,4 мг / мл) белән тулыландырылган эчә торган суда антибиотиклар рекламасы алганнар (болар барысы да Шанхай, Кытай, ясалма организмнар). ].].24 сәгать ашау-эчү сәләтен югалткан һәм ≥ 20% тән авырлыгын югалткан тычканнар карын ягыннан күчерелгән.
WB G. duodenalis trophozoites (Америка тибындагы Мәдәният Коллекциясе, Манас, АКШ) 12,5% фетал бавыры серумы (FBS; Greenәр Яшел, Чжэцзян, Китай) һәм 0,1% бавыр үтләре (Сигма-Алдрич, Сент-Миссури, АКШ) белән тулыландырылды. ).АКШ) микроероб шартларында.Трофозитлар кушылган боз өстендә җыелганнар һәм алга таба үрчү өчен 1: 4 нисбәтендә үткәннәр.
Джардия унике эчәк кисты алда әйтелгәнчә индуктивлык кыла, [23], трофозоитлар логарифмик этапта җыеп алына, аннары 1 × 106 трофозоит / мл концентрациясенә pH 7.1 (үзгәртелгән TYI-S-33) инкапсуляция белән эретелә.үт концентрациясе 0,05% уртача).Трофозоитлар логарифмик үсеш этабына кадәр 37 ° C температурада анаероб шартларында культураланган.Уртача кистны индуктивлык кәтүгенә үзгәртегез (pH 7.8; 1% үт концентрациясе белән үзгәртелгән TYI-S-33 уртача) һәм Г. дуоденалис культурасы 37 ° C 48–96 сәгать эчендә, бу вакытта киста формалашу микроскоп астында күзәтелә.Трофозоитларның күбесе кистлар формалаштырылганнан соң, культураның катнашмасы җыеп алынды һәм калган трофозоитларны лизлау өчен стериль деонизацияләнгән суда реанимацияләнде.Тычканнардагы ашказаны трубасы аша анализлар өчен кисталар саналган һәм 4 ° C сакланган.
Джардия күзәнәктән тыш весикулалар (GEV) алда әйтелгәнчә баетылган [13].Логарифмик үсеш этабындагы тропозитлар үзгәртелгән TYI-S-33 уртада үзгәртелде, экзозом-тузган FBS (Биология Индустриясе, Бейт-Хаемек, Израиль) белән 1 × 106 паразит / мл концентрациясенә кадәр һәм 12 сәгать инкубацияләнде.культура супернантыннан центрифугация белән 2000 г 10 минутка, 10,000 г 45 минутка, һәм 100 000 г 60 минутта изоляцияләнде.Явым-төшемнәр фосфат буферланган тозда (ПБС) эретелде, BCA белок анализлау комплекты ярдәмендә күләмләнде (Термо Фишер Фәнни, Уолтам, МА, АКШ) һәм -80 ° C сакланган яки турыдан-туры анализ өчен кулланылган.
Тычканның төп перитональ макрофаглары алда әйтелгәнчә әзерләнгән [24].Кыскасы, тычканнар (6-8 атна) инъекцияләнгән (интерперитональ [ip]) 2,5 мл 2,98% Дифко сыек тиогликол уртача (BD, Франклин Лейкс, Нью-Йорк, АКШ) һәм 3-4 тәлинкә белән тукландылар.Макрофагларның асылынуы эйтаназиядән соң тычканнарның карын куышлыгыннан җыелган һәм 10 минут эчендә 1000 гда 3 тапкыр центрифугацияләнгән.Cellыелган күзәнәкләр CD11b маркеры ярдәмендә агым чисталыгы> 98% булганчы ачыкланган, аннары 6 кое күзәнәк культурасы тәлинкәләренә кушылган (4,5 х 106 күзәнәк / кое) һәм 37 ° C температурада 10% FBS (биоиндустрия) белән инкубацияләнгән.һәм 5% CO2.
РНК 1 мл 107 трофозоиттан 1 мл TRIzol реагентында (Вазим, Нанкин, Китай) алынган, геном ДНК MonScript dsDNase (Монад, Вухан, Китай) ярдәмендә Г. MonScript RTIIII Супер Микс (Монад) җитештерүче күрсәтмәсе буенча куллану.
Максатлы G. duodenalis гены өчен CDS эзлеклелеге NCBI GenBank -тан алынган.Primerәрбер максатлы ген өчен махсус клонлаштыру праймериз ясау өчен Primer 5.0 кулланыгыз.Алга праймер (5′-3 ′) өч өлештән тора: сызыклы вектор pcDNA3.1 (+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) белән кабатлану эзлеклелеге һәм ATG һәм GNN кодларын башлау (беренче база G булмаса).Бу белдерүнең эффективлыгын күтәрү өчен эшләнә.Моннан тыш, ким дигәндә 16 ат көче кушылган базалар (GC эчтәлеге 40–60% / ТМ якынча 55 ° C).Кире праймер (5′-3 ′) ике өлештән тора, EcoRV сызыклы вектор pcDNA3.1 (+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) һәм ким дигәндә 16 ат көченең берләштерелгән базасы.(соңгы ике тукталыштан кала).нигезләр) рекомбинант плазмидларга маркалы протеиннарны белдерергә рөхсәт итәр өчен AA яки GA кебек код.Праймер эзлеклелеге 1-нче таблицада күрсәтелгән һәм Кангмет Биотехнологияләр ООО (Чанчун, Китай) белән синтезланган.
Максатлар Pfu DNA полимеразы (Тяньген, Пекин, Китай) яки Экс-Так (Такара Биомедицина Технологиясе [Пекин] ООО, Пекин, Китай) ярдәмендә шаблон буларак әзерләнгән G. duodenalis cDNA кулланып көчәйтелде.Эукариотик экспрессор векторы плазмид pcDNA3.1 (+) EcoRV чикләү ферменты белән сызыклы һәм тиз AP (Термо Фишер Фәнни) ярдәмендә депосфориляцияләнгән.Сызыклы pcDNA3.1 (+) фрагментлары һәм көчәйтелгән максатлы ген фрагментлары ДНК гел чистарту комплекты (Тянген) ярдәмендә чистартылды һәм Nanodrop ND-2000 (Термо Фишер Фәнни) ярдәмендә күләмләнде.PCDNA3.1 (+) фрагменты һәм һәрбер максатлы ген фрагменты MonClone бер монтажлау клонлаштыру катнашмасы ярдәмендә рекомбинацияләнде (Monad Biotech Co., Ltd., Сучжоу, Китай) һәм Comate Bioscience Company Limited (Чанчун, Китай) ярдәмендә ДНК эзлеклелеге белән расланды..
Эндотоксинсыз плазмидлар pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 һәм pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 СанПреп Эндотоксинсыз Плазмид Мини комплекты (Сангон Биотех) ярдәмендә ясалган.Концентрация 500 нг / µлдан артык сакланган, элита буферындагы EDTA трансфекция анализына комачауламасын.Беренчел тычкан перитональ макрофаглар 12 скважинада тулы RPMI 1640 урта (Биологик Индустрия) белән 6 скважинада эшкәртелде, аннары күзәнәкләр пенициллинны һәм стрептомицинны чыгару өчен җылы ПБСта 3 тапкыр юылды, аннары тулы урта белән тулыландырылды.Эндотоксинсыз плазмидлар pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 һәм pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 (2,5 μг) 125 μл Опти-МЭМ киметелгән серум уртача (Гибко, Термо Фишер Фәнни)..Аннары 5 µл Липофектамин 2000 трансфекция реагенты (Инвитроген, Термо Фишер Фәнни) 125 µл аз сарым Opti-MEM уртада эретелгән.Липосома-ДНК комплексларын эретелгән эндотоксинсыз плазмидны Липофектамин 2000 белән кушып һәм катнашманы бүлмә температурасында 5 минут торырга рөхсәт итеп әзерләгез.Комплексларны һәр коедагы күзәнәкләргә аерым күчерегез һәм әкренләп кушыгыз.4 сәгатьтән соң күзәнәк культурасы 2 мл тулы RPMI 1640 белән алыштырылды һәм культура 24 сәгать дәвам итте.Күзәнәкләргә яңа күзәнәк культурасы кушылды һәм анализ конструкциясенә карап төрле вакыт пунктлары өчен инкубацияләнде.
Супернатантлардан һәм күзәнәк лизаталарыннан алынган протеин үрнәкләре алда әйтелгәнчә әзерләнгән [25].Про-IL-1β, про-каспаз-1, каспаз-1 p20, NLRP3, β-актин һәм аның тэг өчен мембрананы күчерү параметрлары 200 mA / 90 мин.Интерлеукин 1β (IL-1β; R&D системалары, Миннеаполис, Миннесота, АКШ), каспаз-1 (p20) (Адипоген, Швейцария) һәм NLRP3 (Адипоген СА, Эпалингес, Швейцария) һәм 1: 5000 Вухан, Китай) һәм β-актин (Протеинтех, Вухан, Китай).
Дискуцинимид субераты (DSS) белән үзара бәйләнеш алда әйтелгәнчә башкарылды [26].Күзәнәкләр салкын ПБС белән 3 тапкыр юылды һәм 25 мм Na2PO4, 187,5 мм NaCl, 25 мм HEPES һәм 125 мм NaHCO3 булган 50 µl ASC реакция буферында (pH 8.0) 27 үлчәүле энә белән тулысынча лизизацияләнде.Бу катнашма 5000 г 3 минутта центрифугацияләнде һәм пелет 10 µl DSS (25 мм DMSO) һәм 40 µl ASC реакция буферы белән 30 минутта 37 ° C.10 минут эчендә 5000 г центрифугациядән соң, пелет 40 µл ASC реакция буферы һәм 10 µл 6х протеин йөкләү буферы (TransGen, Пекин, Китай) эретелде, аннары эремә 15 бүлмә температурасында сүндерелде. мин., Аннары 10 минут кайнатырга.Белгеч үрнәкләре аннан соң 1: 500 коэффициентында беренчел анти-антителалар кулланып (Ванлейбио, Шеньян, Китай) Көнбатыш шартлауларына дучар булдылар.
Элегерәк тасвирланган процедура буенча [13] күзәнәк культурасы супернатантлары җыеп алынды һәм IL-1β ялкынсынуга каршы цитокин сигриясе IL-1 Бета ELISA комплекты (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ярдәмендә билгеләнде.OD450nm кыйммәтләрен IL-1β стандарт сызык ярдәмендә протеин концентрациясенә әйләндерегез.
Капка белән капланган күзәнәкләр җылы ПБСта 3 тапкыр әкрен генә юылды, тукымалар күзәнәкләренең фиксиваторында (Биошарп, Пекин, Китай) 10 минут бүлмә температурасында (ТР), 0,1% Тритон X-Пермабилизациядә 100 (ПБСта эретелгән; Биошарп; ) бүлмә температурасында 20 минут эчендә һәм бүлмә температурасында 5% сары альбоминда (ПБС) блоклагыз.Соңыннан күзәнәкләр төнлә 4 ° C температурада ASC (1: 100 эретү) яки NLRP3 (1: 100 эретү) каршы антителалар белән инкубацияләнде, һәм Cy3 куянга каршы кәҗә IgG (H + L) (1: 400; EarthOx) дип язылды. , Сан-Франциско, Калифорния, АКШ) яки FITC-конфигурацияләнгән кәҗә тычканга каршы IgG (1: 400; Эртек) төнлә 37 ° C караңгыда 1 сәгать.Ядрәләр Hoechst 33258 (10 μг / мл; УЕ, Сучжоу, Китай) белән 5 минутка буялганнар һәм флуоресцент микроскоп астында күзәтелгәннәр (Олимп Корпорациясе, Токио, Япония).
Тычканнар дүрт төркемгә бүленде (һәр төркемдә n = 7): (i) ПБС белән эшкәртелгән тискәре контроль төркем (ПБС кына; гаваж 100 µл / тычкан ПБС, аннары көн саен интерперитональ инъекция 100 µл / тычкан ПБС 3 сәгатьтән соң)., 7 көн дәвамында);.(iii) Г..Mouseәр тычканның тән авырлыгы көн саен контрольдә тотылды һәм 7-нче көнне барлык тычканнар эйтанлаштырылды.Уңышлы унике эчәклек (3 см озынлыкта) 1 мл ПБСта кечкенә кисәкләргә киселде, кисталар төнлә ПБСта 4 ° C һәм Г. duodenalis тропозитлары белән юк ителде.Яңа унике эчәклек (озынлыгы 1 см) гематоксилин һәм эозин (H&E) буяу өчен изоляцияләнгән.
Тычканнар ике төркемгә бүленде: (i) MOCK контроль төркеме һәм (ii) MCC950 ингибитор төркеме.Groupәр төркемдә биш дәвалау бар иде (n = 7 / дәвалау төркеме): (i) ПБС белән тискәре контроль төркем (ПБС кына; 100 µл / тычкан ПБС, күзәнәк (IM) инъекциясе (тибиалис антерьер) [28, 29]; ( ii) pcDNA3.1 (+) плазмид тискәре контроль төркем (100 µг / тычкан ДНК, күзәнәк инъекциясе аша) (iii) Г. группа плазмид белән эшкәртелгән pcDNA3.1 (+) - альфа-2 (100 μг / тычкан ДНК, күзәнәк инъекциясе белән), һәм (v) плазмид pcDNA3.1 (+) белән эшләнгән төркем - альфа-7.3 (100 µг / тычкан ДНК, 12 сәгать үткәннән соң, MCC950 ингибитор төркемендәге тычканнар көн саен MCC950 (10 мг / кг тән авырлыгы) интерперитон инъекциясен алдылар, ә MOCK төркемендәге тычканнар тигез күләмдә ПБС дәвалау алды. Кан үрнәкләре Каш тычканнарыннан җыелган һәм төнлә 4 ° C ка калдырылган Серум үрнәкләре фермент белән бәйләнгән иммуносорбент анализы (ELISA) ярдәмендә һәм IL-1β дәрәҗәләрен үлчәү өчен изоляцияләнгән.
Утыз биш тычкан биш төркемгә бүленде (n = 7 / төркем).1 нче группа ПБС белән эшкәртелгән тискәре контроль төркем иде: тычканнар 100 μл ПБСны күзәнәккә һәм 3 көннән соң гаваж белән алдылар.2 нче төркем - G. duodenalis кисталары белән зарарланган уңай контроль төркем: тычканнарга 100 μл ПБС инъекциясе, һәм 3 көннән соң 1,5 х 106 кист / тычкан интрагастрик инъекцияләнде.Өченче төркем - pcDNA3.1 (+) белән плазмид иммунизациясе, унике эчәк кист инфекциясе белән идарә итү төркеме белән берлектә: тычканнар 100 μг плазмид DNA pcDNA3.1 (+) (им) телдән, 1,5 × 106 кист / тычкан 3 өчен көннәр.4 һәм 5 төркемнәр рекомбинант pcDNA3.1 (+) - альфа-2 гиардин плазмид яки pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 гиардин плазмиды Г. duodenalis кист инфекциясе белән берлектә.Эксперимент төркеме: тычканнар 100 µг pcDNA3 алган.1 (+) - гиардин плазмид ДНК (им), аннары 3 көннән соң 1,5 × 106 кист / тычкан гаваж аша укол салдылар.Тычкан аша Г. duodenalis кисты кертелгәннән соң, һәр тычканның тән авырлыгы күзәтелде.Паразитик йөкне үлчәү һәм HE буяу анализы өчен яңа унике эчәклек җыелды.
Гистопатологик үзгәрешләр алдан бастырылган процедура буенча анализланган [30].Яңа унике эчәк тукымалар күзәнәкләре белән төзәтелгән, парафинга салынган, 4 мм бүлекләргә киселгән, H&E белән буялган һәм җиңел микроскоп астында анализланган.Sevenиде мөстәкыйль тычканнан җиде тукымалар бүлегендәге патологик үзгәрешләр патолог белән дәвалануны белми һәм 200х зурлыкта кулга алынган.Вилиның озынлыгы һәм криптларның тирәнлеге алда тасвирланган ысуллар буенча үлчәнде.
Витро һәм виво нәтиҗәләре өчпочмакта алынган.Графиклар GraphPad Prism 7.00 ярдәмендә ясалган (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, АКШ).Ике төркем арасындагы аермалар t-тест белән анализланды, ә groups3 төркемнәр арасындагы аермалар SPSS программа тәэминаты (22.0 версия; SPSS IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, АКШ) ярдәмендә вариантка (ANOVA) анализ ясалды.Левен тестын кулланып, Бонферрониның соңгы тесты (B) ярдәмендә бертөрлелек өчен мәгълүматлар анализланды.Мәгънәсе P <0.05, P <0.01, һәм P <0,001 (мөһим түгел [ns]) (P> 0.05) рәвешендә күрсәтелә.
Киото геннар һәм геномнар энциклопедиясендә (KEGG) GEV протеомикасына алдагы анализыбыз күрсәткәнчә, ялкынлы сигнал юлларын активлаштыруда күп максатлар катнашырга мөмкин [13].Без ике перспективалы максатны сайладык, Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннар, бу молекулаларны көчәйтәбез һәм pcDNA3.1 (+) эукариотик экспресс векторы төзү өчен кулланабыз.Эзләүдән соң, рекомбинант pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардин экспрессия плазмидлары тычканның перитональ макрофагларына күчерелде, һәм каспаз-1 p20 имзасы белок (активлашкан каспаз-1 фрагменты) ачыкланды. ялкынсынуга китерә алган төп молекулаларны аңлату.Нәтиҗә күрсәткәнчә, Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары GEV охшаган p20 каспаз-1 экспрессиясен китерә ала.Каспаз-1 активлаштыруга бернинди эффект та эшкәртелмәгән тискәре контрольдә (ПБС кына) һәм плазмид контроле pcDNA3.1 (+) табылмады (1 нче рәсем).
PcDNA3.1 (+) - p20 каспаз-1 активлаштыруны үлчәү - Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары.Рекомбинант эукариотик экспресс плазмидлар pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары (һәр юл өстендә) тычканның төп перитональ макрофагларына күчерелде һәм культура супернанатлары 24 сәгатьтән соң җыеп алынды.Көнбатыш блотлау каспаз-1 p20 ялкынсыну протеинының имза дәрәҗәсен үлчәү өчен кулланылды.Тискәре контроль буларак ПБС-дәвалау төркеме (С полосасы) һәм pcDNA3.1 (+) монотерапия төркеме (pcDNA3.1 полоса) кулланылды, һәм GEV дәвалау төркеме уңай контроль буларак кулланылды.Рекомбинант белокның чагылышы һәр протеинда гистидин тамгасын табу белән расланды, һәм көтелгән протеин полосалары Альфа-2 гиардин (38,2 кДа) һәм Альфа-7,3 гиардин (37,2 кДа) булган.GEV, Джардия унике эчәклектән тыш весикулалар, pcDNA3.1 (+), EcoRV сызыклы вектор, SUP, супернатант
Альфа-2 гиардин һәм альфа-7.3 гиардин p20 каспаз-1 экспрессиясен тудырганын һәм хуҗаның NLRP3 ялкынсыну реакциясен активлаштыруда роль уйнаганын ачыклау өчен, pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 Гиардин һәм pcDNA3.1 (+) - Альфа -7.3 гиардин рекомбинант плазмид ДНК белән тычканның перитональ макрофагларына күчерелде, һәм NLRP3 төп ялкынлы протеиннарның белдерү дәрәҗәләре, локализациясе һәм олигомеризациясе билгеләнде.Бу экспериментта GEV уңай контроль төркем буларак кулланылды, һәм бернинди дәвалау төркеме (ПБС) яки pcDNA3.1 (+) трансфекция дәвалау төркеме тискәре төркем түгел иде.Нәтиҗә күрсәткәнчә, GEV төркемендәге кебек, гиардин pcDNA3.1 (+) - рекомбинант плазмид ДНК - Альфа-2 һәм Гиардин pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 NLRP3, про-IL-1β һәм регуляциягә китергән. прокаспаз-1 һәм каспаз-1 активлаштыру (2а рәсем).Моннан тыш, ике гиардин да мөһим IL-1β сигресын китерделәр (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; Альфа-2 гиардин: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;Альфа-7.3 гиардин: АНОВА, Ф (4, 10) = 1,625, П <0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0,0047) (2б рәсем).Күпчелек ASC белгечләре мономерик булмаган дәвалау төркемендә яки pcDNA3.1 (+) плазмид белән күчерелгән дәвалау төркемендә, pcDNA3.1 (+) - альфа-2 яки pcDNA3.1 (+) - альфа- 7.3 гиардин.ASC олигомеризациясе GEV уңай контроль төркем яки төркемнең рекомбинант плазмид ДНКсында булды, олигомерик форманы күрсәтте (2 нче рәсем).Бу башлангыч мәгълүматлар Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7,3 гиардин NLRP3 ялкынсыну активлаштырырга мөмкинлеген күрсәтә.Соңрак ASC һәм NLRP3 локализациясенең иммунофлюорсент тикшеренүләре күрсәткәнчә, тискәре контроль төркемдә ASC протеины цитоплазмага таралган һәм pcDNA3.1 (+) - альфа-2 гиардин яки pcDNA3 белән стимуллашканда нокта сигналы булып күренгән.1 (+) - альфа-7,3 гиардин төркеме яки GEV уңай контроль төркем (2 нче рәсем).Тискәре контрольдә һәм плазмид белән эшкәртелгән pcDNA 3.1 төркемнәрендә NLRP3 белок сигналы табылмады, pcDNA3.1 (+) җавапларына флуоресцент сигнал ноктасы - альфа-2 гиардин яки pcDNA3.1 (+) - альфа-7.3 табылды..гиардин цитоплазмада яки HEV стимуляциясендә очрый (2-нче рәсем).Бу мәгълүматлар шулай ук ​​күрсәтә: Г. duodenalis giardin alfa-2 һәм giardin alpha-7.3 тычканның төп перитональ макрофагларында NLRP3 ялкынсынуын активлаштыралар.
pcDNA3.1 (+) - альфа-2 гиардин һәм pcDNA3.1 (+) - альфа-7.3 гиардин тычкан перитональ макрофагларында NLRP3 ялкынсынуны активлаштыра.Рекомбинант эукариотик экспрессия плазмидларын pcDNA3.1 (+) - альфа-2 гиардин һәм pcDNA3.1 (+) - альфа-7.3 гиардинны беренчел мурин перитональ макрофагларына һәм күзәнәкләренә күчерегез, яки супернатантны 24 сәгать эчендә белдерү, олигомеризация өчен җыеп алыгыз. , секреция.һәм төп ялкынлы протеиннарны локализацияләү.Тискәре контроль буларак PBS-ның (C) төркеме һәм pcDNA3.1 (+) бер дәвалау төркеме кулланылды, һәм GEV дәвалау төркеме уңай төркем буларак кулланылды.Көнбатыш шартлаулары белән NLRP3, про-IL-1β, про-каспаз-1, һәм p20 каспаз-1 кебек төп ялкынсыну белгечләре табылды.b Супернантларда IL-1β сигриясе дәрәҗәсе фермент белән бәйләнгән иммуносорбент анализы (ELISA) ярдәмендә билгеләнде.Контроль һәм эксперимент төркемнәр арасындагы аермалар SPSS программа версиясе 22.0 кулланып вариантка (ANOVA) бер яклы анализ ясалды.Йолдызлыклар ** P <0.01 һәм *** P <0,001 төркемнәре арасында зур аерманы күрсәтәләр.в Планеталардагы ASC олигомеризация дәрәҗәсе DSS үзара бәйләнешле анализ белән билгеләнде, ә күзәнәк лизаталарындагы ASC дәрәҗәләре йөкләү контроле буларак кулланылды.d Иммунофлюорсент ярдәмендә ISC локализациясен визуальләштерү.e Иммунофлюорсент NLRP3 локализациясен күз алдына китерү өчен кулланылды.АСК, апоптотик спекка охшаган протеин;IL, интерлеукин;NLRP3, нуклеотид бәйләүче олигомеризация сыман рецептор 3;ns, мөһим түгел (P> 0.05)
G. duodenalis да, ул чыгарган GEVлар да NLRP3 ялкынсынуны активлаштыралар һәм витрода хуҗаның ялкынсыну реакцияләрен көйлиләр.Шулай итеп, Г. duodenalis патогенитетында NLRP3 ялкынсыну роле аңлашылмый кала.Бу проблеманы тикшерү өчен, без Г. duodenalis кисты белән зарарланган тычканнар һәм G. duodenalis кисты + MCC950 ингибиторы белән зарарланган тычканнар арасында эксперимент эшләдек һәм Г. duodenalis кисты белән зарарланганда NLRP3 ялкынсыну экспрессиясен чагыштырдык.Экспериментның җентекле схемасы 3 нче рәсемдә күрсәтелгән.Төрле дәвалау төркемнәрендәге тычканнарның тән авырлыгының үзгәрүе кисталар белән инфекцияләнгәннән соң 7 көн дәвамында күзәтелде, һәм нәтиҗәләр 3б рәсемдә күрсәтелде.Чиста ПБС белән эшкәртелгән төркем белән чагыштырганда, нәтиҗәләр күрсәтте: (i) Г. дуоденалис кисты белән зарарланган тычканнарның тән авырлыгы инфекциядән соң 3 көннән 7 көнгә кадәр кимеде;(ii) MCC950 ингибиторы белән эшкәртү тычканнарның тән авырлыгына бернинди тәэсир итмәде..Бер инфекция төркеме белән чагыштырганда, MCC950 белән эшкәртелгән унике эчәк инфекция төркеменең BW төрле дәрәҗәләргә кадәр кимеде (1-нче көн: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; 2-нче көн: ANOVA, F (3, 24) ) = 0.4602, П <0.0001 көн: ANOVA, F (3, 24) = 0.8360, P = 0,0010 көн: ANOVA, F (3, 24) = 1.683, P = 0.0052; (3, 24) = 0.6497, P = 0.0645;Бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: NLRP3 ялкынсыну тычканнарны унике эчәк инфекциянең башлангыч этапларында (2-4 көн) зур авырлыкны югалтудан саклый.Аннары без унике эчәклек сыеклыгында Г. duodenalis тропозитларын ачыкларга омтылдык һәм нәтиҗәләр 3 нче рәсемдә күрсәтелгән.G. duodenalis кист инфекциясе төркеме белән чагыштырганда, унике эчәклектәге трофозоитлар саны NLRP3 ялкынсыну (t (12) = 2.902, P = 0.0133) блокланганнан соң сизелерлек артты.ПБС һәм MCC950 белән эшкәртелгән тискәре контроль белән чагыштырганда, HE белән буялган унике эчәк тукымалар: (i) Г. ) һәм крипт атрофиясе (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0,0089);(ii) Г. унике эчәк кистасы белән зарарланган һәм MCC950 ингибиторы белән эшкәртелгән тычканнардан унике эчәклек.унике эчәк вилли зарарланган һәм үлгән (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) атрофия һәм крипт ботаклары белән (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (3d- рәсем) f).Бу нәтиҗәләр NLRP3 ялкынсынуының G. duodenalis патогенлыгын киметүдә роль уйнавын күрсәтә.
Джардия унике эчәк инфекциясендә NLRP3 ялкынсыну роле.Тычканнар (iv) унике эндококк кистасы белән гаважировать иттеләр, аннары MCC950 (ip) белән яки аннан башка эшкәртелде.ПБС яки MCC950 белән бер дәвалау төркемнәре контроль буларак кулланылды.Эксперименталь төркем һәм дәвалау режимы.b Төрле дәвалау төркемнәрендәге тычканнарның тән авырлыгы 7 көн контрольдә тотылды.G. duodenalis инфекция төркеме белән G. duodenalis + MCC950 инфекцияне дәвалау төркеме арасындагы аерма SPSS программа версиясе 22.0 ярдәмендә t-тест ярдәмендә анализланды.Йолдызлыклар * P <0.05, ** P <0.01, яки *** P <0,001 дәрәҗәсендә зур аермаларны күрсәтәләр.в Паразитик йөк унике эчәклек сыеклыгында трофозоитлар санын санап билгеләнде.G. duodenalis инфекция төркеме белән G. duodenalis + MCC950 инфекцияне дәвалау төркеме арасындагы аерма SPSS программа версиясе 22.0 ярдәмендә t-тест ярдәмендә анализланды.Йолдызлыклар * P <0.05 зур аермаларны күрсәтәләр.г Гематоксилин һәм эозин (H&E) унике эчәк гистопатология нәтиҗәләре.Кызыл уклар вилиның зыянын күрсәтәләр, яшел уклар криптларның зыянын күрсәтәләр.Масштаб сызыгы: 100 мм.e, f Унике эчәк вилл биеклегенә һәм тычкан крипт биеклегенә статистик анализ.Йолдызлыклар * P <0.05 һәм ** P <0.01 зур аермаларны күрсәтәләр.Нәтиҗәләр 7 бәйсез биологик эксперименттан алынган.BW, тән авырлыгы;ig, интрагастрик тапшыру маршруты;ip, интерперитональ тапшыру маршруты;ns, мөһим түгел (P> 0.05);ПБС, фосфат буферланган тоз;ВТ, кыргый тип
IL-1β сигриясе - ялкынсыну активлашу билгесе.Г. дуоденалис Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7.3 гиардин NLRP3 хуҗасы ялкынсынуны вивода активлаштырамы, юкмы икәнен ачыклау өчен, без дәваланмаган WT тычканнарын (шам группасы) һәм NLRP3 ялкынлы блоклы тычканнарны кулландык (MCC950 тыелган дәвалау төркеме).Экспериментның җентекле схемасы 4 нче рәсемдә күрсәтелгән.Эксперимент төркемнәре ПБС белән эшләнгән тычканнардан, Г. дуэденалис кист белән гаваж белән эшкәртүдән, pcDNA3.1 инъекциядән, һәм pcDNA3.1 (+) - күзәнәккә инъекциядән - альфа-2 гиардин яки pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардиннан торды.Рекомбинант плазмидның күзәнәк-күзәнәк идарәсеннән соң 7-нче көнне зарум җыелды һәм һәр төркемдә IL-1β дәрәҗәсе билгеләнде.4б рәсемдә күрсәтелгәнчә, MOCK төркемендә: (i) ПБС төркеме белән чагыштырганда, pcDNA3.1 дәвалау IL-1β сигресенә бернинди тәэсир итмәде (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), ләкин IL-β сигриясе Г. дуэденалис кист төркемендә (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-альфа-2 гиардин һәм pcDNA3да сизелерлек күтәрелде.1- Альфа-7.3 гиардинга күзәнәк инъекциясе IL-1β серумын сизелерлек арттырды (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3. .MCC950 дәвалау төркемендәге һәм MOCK төркемендәге һәр төркем белән чагыштырганда: (i) ПБС контроль төркемендәге һәм pcDNA3.1 контроль төркемендәге IL-1β сигрес дәрәҗәсе MCC950 ингибиторын блоклаганнан соң билгеле бер дәрәҗәдә кимеде, ләкин аерма булмады. әһәмиятле (ПБС: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 блоклаганнан соң., G. duodenalis кист белән зарарланган группада, pcDNA3.1-альфа-2 гиардин группасында, һәм pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин төркемендә (G. duodenalis: ANOVA, F (9) сизелерлек кимеде. , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-альфа-2 гиардин: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164).Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7.3 гиардин NLRP3 ялкынсыну вивода активлаша.
pcDNA3.1 (+) - гиардиннар NLRP3 хуҗасы ялкынсынуны вивода активлаштыралар.Тычканнар рекомбинант эукариотик экспресс плазмид pcDNA3.1 (+) - иммунизацияләнде (альфа-2 гиардин яки pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 гиардин, аннары MCC950 (ip; MCC950 төркеме) белән эшкәртелде (группа төркеме) ).ПБС яки pcDNA3.1 (+) плазмид белән эшкәртү төркеме тискәре контроль буларак кулланылды, Г. duodenalis кистын дәвалау төркеме уңай контроль буларак кулланылды.Эксперименталь төркем һәм дәвалау режимы.b Тычканнардагы IL-1β серум дәрәҗәсе 7-нче көнне ELISA анализы белән үлчәнде.MOCK төркемендәге төркемнәр арасындагы аермалар бер яклы ANOVA ярдәмендә анализланды, һәм MOCK төркеме белән MCC950 төркеме арасындагы аермалар SPSS программа 22.0 версиясенең t-тесты ярдәмендә анализланды.Йолдызлыклар MOCK төркемендәге дәвалау төркемнәре арасында зур аерманы күрсәтәләр, * P <0.05 һәм *** P <0,001;доллар билгеләре ($) MOCK төркемендәге һәр төркем белән P <0.05 дәрәҗәсендә MCC950 төркеме арасында зур аерманы күрсәтәләр.Sevenиде бәйсез биологик эксперимент нәтиҗәләре.i, күзәнәккә инъекция, нс, мөһим түгел (P> 0.05)
Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардин-арадаш NLRP3 хуҗасы ялкынсынуның Г. унике эчәк инфекциясенә тәэсирен тикшерү өчен, без WT C57BL / 6 тычканнарын кулландык һәм Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7.3 гиардин салдык.плазмид күзәнәккә инъекцияләнгән, 3 көннән соң Г. унике эчәк кистасы ашказаны трубасы аша, тычканнар 7 көн күзәтелгән.Экспериментның җентекле схемасы 5а рәсемдә күрсәтелгән.Mouseәр тычканның тән авырлыгы көн саен үлчәнде, яңа унике эчәк тукыманың үрнәкләре ашказаны трубасы аша 7-нче көнне җыелды, трофозоитлар саны үлчәнде, һәм гистопатологик үзгәрешләр күзәтелде.5б рәсемдә күрсәтелгәнчә, туклану вакыты арту белән, һәр төркемдәге BW тычканнары әкренләп артты.Тычканнар МТ 3-нче көнне Г. дуоденалис кисталарын интрагастрик кулланганнан соң кими башлады, аннары әкренләп артты.Альфа-2 гиардин һәм альфа 7.3 гиардинга күзәнәк инъекциясе ярдәмендә NLRP3 ялкынсыну активлашуы тычканнарда авырлыкны киметте (1-нче көн: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0. = 0.3172, P = 0.9979 2 көн: pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 3 көн: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA, F (; 4, 30.) , F (4, 30) = 0.5620, P = 0,0012, 4 көн: pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P <0.0001, 5 көн: pcDNA3.1-альфа - 2 гиардин, АНОВА, Ф (4, 30) = 0.9728, П <0.0001 5 көн: pcDNA3.1-альфа -7.3 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 6 көн: pcDNA3 .1 - Альфа-2 гиардин, АНОВА, Ф (4, 30) = 0.7154, П = 0,0012, 6 көн: pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7 нче көн: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 0.5369, P <0.0001 7 көн: pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин, ANOVA, F (4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Паразитик йөк унике эчәклектә бәяләнде (5с рәсем).Тазартылмаган уңай контроль һәм буш pcDNA3.1 векторы белән инъекцияләнгән төркем белән чагыштырганда, G. duodenalis тропозоитлары саны α-2 гиардин һәм α-7,3 гиардин (pcDNA3.1-альфа) белән инъекцияләнгән төркемнәрдә сизелерлек кимеде. -2 гиардин: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P <0.0001).Моннан тыш, гиардин алфа-7.3 тычканнарда гиардин алфа-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0,0081) караганда саклаучы иде.HE буяу нәтиҗәләре инҗирдә күрсәтелгән.5d - f.Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7.3 гиардин белән инъекцияләнгән тычканнарның унике эчәк тукымаларындагы лезонияләре азрак булган, вилус зарарлыгы белән күрсәтелгән, Г. дуэденалисы белән тычканнар һәм Г. дуоденалисы белән инъекцияләнгән тычканнар буш pcDNA3 векторы белән берлектә .1 Зурлау.(pcDNA3. = 0.0028 яки P = 0,0055) һәм киметелгән крипт атрофиясе (pcDNA3.1-альфа-2 гиардин: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 яки P = 0.0158; pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин: ANOVA , F (3, 24) = 1.470, P = 0.0371 яки P = 0.0191).Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7,3 гиардин Г. duodenalis инфекциясен киметә, NLRP3 ялкынсынуны вивода активлаштырып.
PCDNA3.1 (+) роле - Г. унике эчәк инфекциясендә гиардиннар.Тычканнар рекомбинант эукариотик плазмидлар белән иммунизацияләнде pcDNA3.1 (+) - Альфа-2 гиардин яки pcDNA3.1 (+) - Альфа-7.3 гиардин, аннары Г. дуоденалис кистлары (ig) белән көрәштеләр.ПБС төркеме һәм pcDNA3.1 (+) + унике эчәк кистны дәвалау төркеме тискәре контроль төркем буларак кулланылды, һәм унике эчәк кистын дәвалау төркеме уңай контроль төркем буларак кулланылды.Эксперименталь төркем һәм дәвалау режимы.b Төрле дәвалау төркемнәренең һәрберсендә MT тычканнары 7 көннән соң контрольдә тотылды.Астерисклар G. duodenalis төркемендәге төркемнәр һәм pcDNA3.1 (+) - альфа-2 гиардин төркеме, * P <0.05, ** P <0.01, һәм *** P <0,001;доллар билгесе ($) Г. duodenalis төркеме белән pcDNA3.1 (+) арасында зур аерманы күрсәтә - альфа-7.3 ярдин төркеме, $$ P <0.01 һәм $$$ P <0,001.в Паразитик йөк унике эчәклектән (3 см озынлыкта) 1 мл унике эчәклектәге трофозоитлар санын санап билгеләнде һәм унике см өчен паразитлар саны итеп күрсәтелде.G. duodenalis инфекция төркеме, pcDNA3.1 (+) - альфа-2 гиардин төркеме, һәм pcDNA3.1 (+) - альфа-7.3 гиардин төркеме арасындагы аермалар SPSS программа версиясе 22.0 ярдәмендә ANOVA тарафыннан анализланган.Йолдызлыклар ** P <0.01 һәм *** P <0,001 дәрәҗәсендә зур аермаларны күрсәтәләр.d Унике эчәклектә гистопатологик үзгәрешләр.Кызыл уклар вилиның зыянын күрсәтәләр, яшел уклар криптларның зыянын күрсәтәләр.Масштаб сызыгы: 100 мм.e, f Тычканның унике вилл биеклеген статистик анализлау (e) һәм крипт биеклеге (f).1-нче рәсемдәге төркемнәр арасындагы аермалар SPSS программа версиясе 22.0 ярдәмендә ANOVA белән анализланган.Йолдызлыклар * P <0.05 һәм ** P <0.01 зур аермаларны күрсәтәләр.Sevenиде бәйсез биологик эксперимент нәтиҗәләре.ns, мөһим түгел (P> 0.05)
Джардия унике эчәклеге - билгеле эчәк паразиты һәм гиардиаз китереп чыгаручы башка имезүчеләр.2004-нче елда, БСО игътибарсыз калган авырулар инициативасына кертелде, чөнки 6 ел эчендә таралуы, аеруча түбән социаль-икътисади статуслы җәмгыятьләрдә [32].Тумыштан килгән иммун системасы Г. duodenalis инфекциясенә каршы иммун реакциядә мөһим роль уйный.Тычкан макрофаглары Г. дуоденалисын тыштан тыш тозаклар җибәреп үтерәләр һәм үтерәләр дип хәбәр иттеләр [33].Элеккеге тикшеренүләребез күрсәткәнчә, инвазив булмаган күзәнәк паразиты Г. duodenalis, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, һәм NLRP3 тычкан макрофагларында ялкынсыну сигнал юлларын активлаштыра, һәм GEV чыгарылган бу процессны көчәйтә ала.13], 24].Ләкин, GEV-та NLRP3 ялкынсыну белән көйләнгән ялкынсынуда катнашкан төгәл PAMPлар һәм гиардиазда NLRP3 ялкынсыну роле аңлатыла.Бу ике сорауга яктырту өчен, без бу өйрәнүне үткәрдек.
NLRP3 ялкынсыну иммун күзәнәкләренең цитоплазмасында урнашкан һәм сид кислотасы кристалллары, токсиннар, бактерияләр, вируслар һәм паразитлар кебек төрле кисәкчәләр белән активлашырга мөмкин.Бактерия тикшеренүләрендә токсиннар ялкынсыну сенсорларын активлаштыручы, ялкынсынуга һәм күзәнәк үлеменә китерүче төп PAMPлар итеп билгеләнде [34].Кайбер структур яктан төрле токсиннар, мәсәлән, Стафилококк ауреусыннан гемолизин [35] һәм Эчеричия коли [36], энтеротоксиннан (NHE) гемолизин BL (HBL) NLRP3 ялкынсынуына этәрә.Вируслы тикшеренүләр күрсәткәнчә, вируслылык белгечләре, мәсәлән, SARS-COV-2 конверт (E) белок [38] һәм Zika вирусы NS5 аксымы [39] NLRP3 рецепторы тарафыннан танылган мөһим PAMPлар.Паразит тикшеренүләрендә күп паразитларның Токсоплазма гондии, Трихомонас вагиналисы [40], Трипаносома крузи [41], Лейшмания кебек ялкынсыну активлашуы белән бәйле булулары хәбәр ителде.Токсоплазма гондии вируслылыгы белән бәйле тыгыз гранул белгечләре GRA35, GRA42, һәм GRA43, Льюис тычкан макрофагларында пироптоз индукциясе өчен кирәк [43].Моннан тыш, кайбер Лейшмания тикшеренүләре NLRP3 ялкынсынуында катнашкан аерым молекулаларга юнәлтелгән, мәсәлән, паразит мембранасы липофосфоглиган [44] яки цинк металлопротеаз [45].Аннексинга охшаган Альфа-Гиардиннар гаиләсе арасында, Альфа-1 гиардин тычкан моделендә Г. дуоденалисыннан саклауны тәэмин итүче потенциаль вакцина кандидаты булып күрсәтелде [18].Безнең тикшерүдә без Г. duodenalis вирулентлык факторларын алфа-2 һәм альфа-7,3 гиардинаны сайладык, алар гиардиягә генә хас, ләкин чагыштырмача аз хәбәр ителә.Бу ике максатлы ген ялкынсыну активлыгын анализлау өчен pcDNA3.1 (+) эукариотик экспресс системасы векторына клонланган.
Безнең тычкан моделендә ярылган каспаз фрагментлары ялкынсыну активлашу билгесе булып хезмәт итә.Стимуллашканнан соң, NLRP3 ASC белән үзара бәйләнештә тора, прокаспазлар туплый, һәм IL-1β һәм IL-18 про-IL-18-ны җитлеккән IL-1β һәм IL-18 белән актив каспазлар чыгара.Ялкынландыргыч каспазлар (каспазлар-1, -4, -5 һәм -11) - тумыштан саклану өчен бик мөһим булган, ялкынсынуда һәм программаланган күзәнәк үлемендә катнашкан цистин протеазларының сакланган гаиләсе [46].Каспаз-1 каноник ялкынсыну белән активлаштырыла [47], ә каспаз-4, -5, -11 атипик ялкынсыну барлыкка килгәндә ярыла [48].Бу тикшеренүдә без тычкан перитональ макрофагларын модель итеп кулландык һәм Г. duodenalis инфекциясен өйрәнгәндә NLRP3 ялкынсыну активлыгы билгесе буларак p20 каспаз-1 ярылган каспаз-1 тикшердек.Нәтиҗә күрсәткәнчә, күп альфа-гиардиннар ялкынсынуның типик активлашуы өчен җаваплы, бу бактерияләр һәм вируслар катнашкан төп вируслылык молекулаларын табу белән туры килә.Ләкин, безнең тикшерү беренчел экран гына, һәм классик булмаган ялкынсынуларны активлаштыра алырлык башка молекулалар бар, чөнки алдагы өйрәнүебез Г. дуоденалис инфекциясендә классик һәм классик булмаган ялкынсынуларны тапкан [13].Алга таба ясалган p20 каспаз-1 NLRP3 ялкынсыну белән бәйләнгәнме-юкмы икәнен ачыклау өчен, без альфа-2 һәм альфа-7.3 гиардиннарын тычкан перитональ макрофагларына күчердек, төп молекула белок белдерү дәрәҗәсен һәм ASC олигомеризация дәрәҗәсен, α-гиардиннарның да актив булуын раслыйбыз. ялкынлы NLRP3.Безнең нәтиҗәләр Манко-Прыхода һ.б. нәтиҗәләреннән бераз аерылып торалар, алар Caco-2 күзәнәкләрен Г. muris яки E. coli EPEC штаммнары белән стимуллаштыру NLRP3, ASC, һәм каспаз-1, флюоресенция интенсивлыгын арттырырга мөмкин дип хәбәр иттеләр. сизелерлек булмаса да, Г. мурис һәм Э.Коли костимуляциясе өч аксым дәрәҗәсен арттырдылар [49].Бу туры килмәү Джардия төрләрен, күзәнәк сызыкларын һәм төп күзәнәкләрне сайлаудагы аермалар аркасында булырга мөмкин.Без шулай ук ​​5 атналык хатын-кыз WT C57BL / 6 тычканнарда MCC950 кулланып vivo анализ ясадык, алар Г. дуоденалисына җиңелрәк.MCC950 - көчле һәм сайлап алынган кечкенә молекула NLRP3 ингибиторы, наномоляр концентрацияләрдә каноник һәм каноник булмаган NLRP3 активлашуны блоклый.MCC950 NLRP3 активлаштыруны тыя, ләкин AIM2, NLRC4, һәм NLRP1 ялкынсыну юлларына яки TLR сигнал юлларына активлашмый [27].MCC950 NLRP3 активлаштыруны блоклый, ләкин NLRP3 инициативасын, K + эффлюкс, Ca2 + агымын, яки NLRP3 һәм ASC арасындагы үзара бәйләнешне тыя алмый.киресенчә, ул ASC олигомеризациясен блоклап NLRP3 ялкынсынуны активлаштыра [27].Шуңа күрә, без гиардин инъекциясеннән соң NLRP3 ялкынсыну ролен ачыклау өчен vivo өйрәнүендә MCC950 кулландык.Активлаштырылган каспаз-1 p10 ялкынсынучан цитокиннарны IL-1β һәм IL-18 про-IL-1β һәм IL-18 [50] итеп яралар.Бу тикшеренүдә, гиардин белән эшкәртелгән тычканнарда IL-1β дәрәҗәсе, MCC950 белән яки аннан башка, NLRP3 ялкынсыну активлыгы күрсәткече буларак кулланылды.Көтелгәнчә, MCC950 дәвалау зарарлы IL-1β дәрәҗәсен сизелерлек киметте.Бу мәгълүматлар ачыклый, Г. duodenalis giardin alfa-2 һәм giardin alfa-7.3 NLRP3 тычкан ялкынсынуын активлаштыра ала.
Соңгы дистә ел эчендә тупланган мөһим мәгълүматлар IL-17Aның Г. муриска каршы иммунитетның төп көйләүчесе булуын, IL-17RA сигнализациясен, антимикробиаль пептидлар җитештерүне һәм тулыландыруны активлаштыруны күрсәтте [51].Ләкин, Джардия инфекциясе яшь өлкәннәрдә еш очрый, һәм хәбәр ителгәнчә, яшь тычканнардагы Джардия инфекциясе аның саклагыч эффектын куллану өчен IL-17A реакциясен активлаштырмый, тикшерүчеләрне башка иммуномодулятор Джардия эзләргә этәрә.гельминт инфекциясе механизмнары.Күптән түгел үткәрелгән тикшеренү авторлары хәбәр иткәнчә, Г. мурис NLRP3 ялкынсынуны E. coli EPEC активлаштыра ала, бу антимикробиаль пептидлар җитештерүне көчәйтә һәм эчәк трактындагы трофозоитлар санын киметә, шуның белән эчәк авырлыгын киметә. бакилли аркасында китерелгән авырулар [49].NLRP3 ялкынсыну төрле авырулар үсешендә катнаша.Тикшеренүләр күрсәткәнчә, псевдомонас аэругиноза күзәнәк үлеменнән саклану өчен макрофагларда автофагны этәрә, һәм бу процесс NLRP3 ялкынсынуының активлашуына бәйле.Н. канинум өчен, реактив кислород төрләре-NLRP3 ялкынсыну активлашуы, хуҗада кабатлануны чикли, һәм аны потенциаль терапевтик максат итеп куя [9].Paracoccidioides brasiliensis тычкан сөяге җиләгеннән алынган дендрит күзәнәкләрендә NLRP3 ялкынсынуының активлашуына китерә, нәтиҗәдә хуҗа оборонасында мөһим роль уйный торган IL-1β цитокины чыгарыла [10].Лейшманиянең берничә төре, шул исәптән Л. amazonensis, L. major, L. braziliensis, and L. infantum chagasi, NLRP3 һәм ASC-ка бәйле каспаз-1ны макрофагларда активлаштыралар, шулай ук ​​Лейшмания инфекциясен.Паразитны кабатлау NLRP3 / ASC / каспаз-1 гендагы тычканнар җитешсезлегендә көчәйтелә [11].Замбони һ.б.Лейшмания инфекциясе NLRP3 ялкынсынуының макрофагларда активлашуы турында хәбәр итә, бу күзәнәкләр эчендәге паразит репликасын чикли.Шулай итеп, Лейшмания NLRP3 активлаштыруны качу стратегиясе итеп тоткарлый ала.Vivo тикшеренүләрендә NLRP3 ялкынсыну Лейшманияне юкка чыгарырга ярдәм итте, ләкин тукымаларга тәэсир итмәде [54].Киресенчә, гельминтиаз тикшеренүләрендә, NLRP3 ялкынсыну активлашуы хуҗаның ашказаны-эчәк гельминтиазыннан саклаучы иммунитетын бастырды [12].Шигелла - бөтен дөньяда эч китүгә китерүче төп бактерияләрнең берсе.Бу бактерияләр IL-1β җитештерүне P2X7 рецептор-арадашлы K + эффлюкс, реактив кислород төрләре, лизосомаль кислоталау һәм митохондрия зарарлары аша җибәрә ала.NLRP3 ялкынсыну фагоцитозны һәм макрофагларның бактерицид активлыгын Шигеллага каршы тискәре көйли [55].Плазмодиум тикшеренүләре күрсәткәнчә, Плазмодиум белән зарарланган AIM2, NLRP3 яки каспаз-1 дефицит тычканнар 1 типтагы интерферон җитештерәләр һәм Пласмодиум инфекциясенә чыдамрак [56].Ләкин, тычканнарда NLRP3 ялкынсынуының патоген активлашуында Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7.3 гиардинның роле аңлашылмый.
Бу тикшеренүдә, NLRP3 ялкынсынуының MCC950 тарафыннан тыелуы BWны киметте һәм тычканнардагы эчәк лавада сыеклыктагы трофозоитлар санын арттырды, нәтиҗәдә унике эчәк тукымасында катгый патологик үзгәрешләр барлыкка килде.Альфа-2 гиардин һәм Альфа-7.3 гиардин тычкан NLRP3 ялкынсынуны активлаштыралар, тычкан тәненең авырлыгын арттыралар, эчәк лавада сыеклыктагы трофозоитлар санын киметәләр, һәм патологик унике эчәк лезонияләрен җиңеләйтәләр.Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: Г. duodenalis NLRP3 хуҗасы ялкынсынуны альфа-2 гиардин һәм альфа-7,3 гиардин аша активлаштыра ала, тычканнардагы Г. дуоденалисының патогенлыгын киметә.
Коллектив рәвештә, безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: Альфа-2 һәм Альфа-7.3 гиардиннары NLRP3 хуҗасы ялкынсынуны активлаштыра һәм тычканнарда Г. дуоденалисының инфекциясен киметә.Шуңа күрә, бу молекулалар гиардиазны профилактикалау өчен өметле максатлар.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Гиардиаз: гомуми күзәтү.Күптән түгел Пэт Инфламмның наркотикларга аллергиясе барлыгы ачыкланды.2019; 13: 134–43.
Эскобедо А.А., imимерман С. Джиардиаз: фармакотерапиягә күзәтү.Фармацевтның эксперт фикере.2007;8: 1885–902.
Тянь Хуафенг, Чен Бин, Вен ianзянфэнг.Гиардиаз, наркотикларга каршы тору һәм яңа максатлар табу.Инфекцияләр Наркотикларның максатларын бозалар.2010; 10: 295-302.
Ван З, Чжан X, Сяо И, Чжан В, Ву Х, inин Т һ.б. NLRP3 ялкынсыну һәм ялкынсыну авырулары.Оксид мед күзәнәкләре Лонгев.2020; 2020: 4063562.
Чен Ги, Нúез Г. Эчәкнең ялкынсынуында һәм яман шештә ялкынсынуның роле.Гастроэнтерология.2011;141: 1986–99.
Пеллегрини С, Антониоли Л, Лопес-Кастежон Г, Бландиззи С, Форнай М.иммун алдыннан.2017; 8: 36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S һ.б.Н. канин инфекциясенә каршы ROS-арадаш NLRP3 ялкынсыну активлашуы катнаша.Паразит векторы.2020; 13: 449.