Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузер версиясенең CSS ярдәме чикләнгән.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Токсоплазма гондии - күзәнәкләр эчендәге протозоан паразиты, ул зарарланган хуҗаның микроэнергиясен модульләштерә һәм баш ми шешенең үсүе белән бәйле.Бу тикшеренүдә без Токсоплазма инфекциясеннән экзосомаль miRNA-21 ми шешенең үсешенә ярдәм итә дип фаразлыйбыз.Токсоплазма белән зарарланган BV2 микроглиясеннән экзозоматлар характерланган һәм U87 глиома күзәнәкләренең эчкеләшүе расланган.Экзосомаль микроРНА экспресс профильләре Токсоплазма гондии һәм шеш сортировкасы белән бәйле микроРНА һәм микроРНА-21А-5п массивлары ярдәмендә анализланган.Без шулай ук ​​U87 глиома күзәнәкләрендәге шеш белән бәйле геннарның mRNA дәрәҗәсен тикшердек, экзозомалардагы miR-21 дәрәҗәсен үзгәртеп, кеше U87 глиома күзәнәкләренең таралуына тәэсирен тикшердек.Токсоплазма гондии белән зарарланган U87 глиома күзәнәкләренең экзозомаларында микроРНА-21 экспрессиясе көчәя һәм антимонополь геннарның активлыгы кими (FoxO1, PTEN, PDCD4).Токсоплазма белән зарарланган BV2 алынган экзозомнар U87 глиома күзәнәкләренең таралуына китерә.Экзозомнар тычкан шеше моделендә U87 күзәнәкләренең үсешенә этәрә.Токсоплазма белән зарарланган BV2 микроглиясендә экзосомаль miR-21 арту, антимонополь геннарны регуляцияләп, U87 глиома күзәнәкләрендә күзәнәк үсешен пропагандалаучы роль уйный ала.
2018-нче елда бөтен дөнья буенча 18,1 миллионнан артык алдынгы яман шеш авыруы диагнозы куелган, ел саен якынча 297,000 үзәк нерв системасы шешләре диагнозы куелган (барлык шешләрнең 1,6%) 1.Элеккеге тикшеренүләр күрсәткәнчә, кеше ми шешләрен үстерү өчен куркыныч факторларга төрле химик продуктлар, гаилә тарихы, баш терапевтик һәм диагностика җиһазларыннан ионлаштыручы нурланыш керә.Ләкин, бу яманлыкның төгәл сәбәбе билгеле түгел.Бөтен дөньядагы яман шеш авыруларының якынча 20% йогышлы агентлар, шул исәптән вируслар, бактерияләр һәм паразитлар аркасында килеп чыга.Йогышлы патогеннар хуҗа күзәнәкнең генетик механизмнарын бозалар, мәсәлән, ДНК ремонтлау һәм күзәнәк циклы, һәм хроник ялкынсынуга һәм иммун системасына зыян китерергә мөмкин5.
Кеше яман шеш авыруы белән бәйле йогышлы агентлар - вируслы патогеннар, шул исәптән кеше папилломавируслары, В һәм С гепатиты.Паразитлар шулай ук ​​кеше яман шешенең үсешендә потенциаль роль уйный алалар.Берничә паразит төре, ягъни Шистосома, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis һәм Hymenolepis nana, төрле рак авыруларында 6,7,8 катнашкан.
Токсоплазма гондии - күзәнәкләр эчендәге протозоан, зарарланган күзәнәкләрнең микроэнергиясен көйли.Бу паразит бөтен дөнья халкының якынча 30% -ын зарарлый, бөтен халыкны куркыныч астына куя 9,10.Токсоплазма гондии мөһим органнарны, шул исәптән үзәк нерв системасын (CNS) зарарлый ала, һәм үлемгә китерүче менингит һәм энцефалит кебек җитди авырулар китерергә мөмкин, аеруча иммунокомпромизацияләнгән пациентларда9.Ләкин, Токсоплазма гондии шулай ук ​​зарарланган хуҗаның әйләнә-тирәсен үзгәртә ала, иммунокомпетент шәхесләрдә күзәнәк үсешен һәм иммун реакцияләрен үзгәртеп, асимптоматик хроник инфекцияне саклап калуга китерә 9,11.Кызык, Т.Гондий таралуы һәм баш миендәге шеш очраклары арасындагы бәйләнешне исәпкә алып, кайбер докладларда хроник Т.Гондии инфекциясе аркасында экологик үзгәрешләр шеш микроэнергетикасына охшаган.
Экзозомнар күрше күзәнәкләрдән биологик эчтәлек, шул исәптән протеиннар һәм нуклеин кислоталары китерүче, күзәнәкара элемтәче буларак билгеле.Экзозомнар шеш белән бәйле биологик процессларга тәэсир итә ала, анти-апоптоз, ангиогенез, шеш микроэнергиясендә метастаз.Аерым алганда, miRNAs (miRNAs), озынлыгы 22 нуклеотид булган кечкенә кодсыз РНКлар, транскрипциядән соң мөһим ген регуляторлары, алар miRNA-индуктив сүндерү комплексы (miRISC) аша кеше mRNA-ның 30% тан артыгын контрольдә тота.Токсоплазма гондии зарарланган хуҗаларда miRNA экспрессиясен контрольдә тотып биологик процессларны бозырга мөмкин.Алып баручы miRNA-ларда паразитның исән калу стратегиясенә ирешү өчен биологик процессларны көйләү өчен мөһим сигналлар бар.Шулай итеп, Т.Гондии белән инфекцияләнгәннән соң, хуҗа miRNA профилендәге үзгәрешләрне өйрәнү безгә хуҗа белән Т.Гондийның үзара бәйләнешен аңларга ярдәм итә ала.Чыннан да, Тиругнанам һ.б.15 Т.Гондийның шеш үсүе белән бәйле махсус хуҗа miRNA-ларында чагылышын үзгәртеп, ми карсиногенезын алга этәрүен тәкъдим итте һәм Т.Гондии эксперименталь хайваннарда глиомага китерә алуын ачыклады.
Бу тикшеренү Токсоплазма BV2 белән зарарланган хуҗа микроглиядә экзосомаль miR-21 үзгәрүенә юнәлтелгән.U87 глиома күзәнәкләренең үсешендә үзгәртелгән экзосомаль miR-21 ролен күзәттек, чиктән тыш кысылган miR-21 максаты булган FoxO1 / p27 ядросында саклану аркасында.
BV2-дән алынган экзозомнар дифференциаль центрифугация ярдәмендә алынган һәм кәрәзле компонентлар яки бүтән весикулалар белән пычрану өчен төрле ысуллар белән расланган.SDS-полиакриламид гели электрофорезы (SDS-PAGE) BV2 күзәнәкләреннән һәм экзозомалардан алынган аксымнар арасында аерылып торган үрнәкләр күрсәтте (1A рәсем), һәм үрнәкләр Alix булуына бәяләнде, алар Көнбатышның экзосомаль белок маркерлары белән анализланган.Аликс маркировкасы экзозома белгечләрендә табылган, ләкин BV2 күзәнәк лизат белгечләрендә түгел (1Б рәсем).Моннан тыш, BV2-дән алынган экзозоматлардан чистартылган РНК биоанализер ярдәмендә анализланды.18S һәм 28S рибосомаль субунитлар экзозомаль РНК миграция үрнәгендә бик сирәк күзәтелә, ышанычлы чисталыкны күрсәтә (Рәсем 1C).Ниһаять, электрон микроскопия тапшыру күзәтелгән экзозомнарның якынча 60-150 нм зурлыкта булуын һәм экзозома морфологиясенә хас касәгә охшаган структура булуын күрсәтте (1Д рәсем).
BV2 күзәнәкләреннән алынган экзозомаларга характеристика.А) Куркынычсызлык мәгълүматлары бите.Аксымнар BV2 күзәнәкләреннән яки BV2-дән алынган экзозомалардан изоляцияләнгән.Протеин үрнәкләре күзәнәкләр һәм экзозомалар арасында аерыла.Б) Экзосомаль маркерның көнбатыш блот анализы (Аликс).(C) Биоанализер ярдәмендә BV2 күзәнәкләреннән һәм BV2 алынган экзозоматлардан чистартылган РНКны бәяләү.Шулай итеп, BV2 күзәнәкләрендәге 18S һәм 28S рибосомаль субунитлар экзосомаль РНКда бик сирәк очрый.(D) Электрон микроскопия тапшыру күрсәтте, BV2 күзәнәкләреннән изоляцияләнгән экзозомнар 2% уранил asetat белән тискәре тапланган.Экзозомнар якынча 60-150 нм зурлыкта һәм чынаяк формасында (Songыр һәм ungнг, басылмаган мәгълүматлар).
Конвокаль микроскопия ярдәмендә B82 алынган экзозоматларның U87 кеше глиомасы күзәнәкләренә күзәнәк интернизациясе күзәтелде.PKH26 маркалы экзозомалар U87 күзәнәкләренең цитоплазмасында локальләштерелгән.Ядрәләр DAPI белән буялган (2A рәсем), бу BV2-дан алынган экзозоматларның төп күзәнәкләр белән эчкеләштерелүен һәм алучы күзәнәкләр мохитенә йогынты ясавын күрсәтә.
BV2-дан алынган экзозомнарны U87 глиома күзәнәкләренә һәм Токсоплазма RH белән зарарланган BV2-экзозомнарны U87 глиома күзәнәкләренең таралуына китерде.А) Конококаль микроскопия белән үлчәнгән U87 күзәнәкләре белән капланган экзозомнар.U87 глиома күзәнәкләре PKH26 (кызыл) дип язылган яки 24 сәгать контрольсез экзозомалар белән инкубацияләнде.Ядрәләр DAPI (зәңгәр) белән буялганнар, аннары конокаль микроскоп астында күзәтелгән (масштаблы штрих: 10 μm, x 3000).(B) U87 глиома күзәнәкләренең таралуы күзәнәк таралу анализы белән билгеләнде.U87 глиома күзәнәкләре күрсәтелгән вакыт өчен экзозомалар белән эшкәртелде. * P <0.05 Студентларның тесты белән алынган. * P <0.05 Студентларның тесты белән алынган. * П <0,05 получено по т-критерию Стьюдента. * П <0.05 Студентларның т-тесты. * P <0.05 通过 学生 t 检验。。 * П <0.05 * П <0,05, полученный с помощю т-критерия Стьюдента. * П <0.05 Студентларның т-тесты ярдәмендә алынган.
BV2 алынган экзозоматларның U87 глиома күзәнәкләренә эчкеләшүен раслаганнан соң, без кеше глиомасы күзәнәкләре үсешендә BV2 алынган Токсоплазмадан алынган экзозомаларның ролен тикшерү өчен күзәнәкләр таралу анализларын ясадык.У.
Моннан тыш, U118 күзәнәкләренең үсеше U87 белән бер үк нәтиҗәләргә иреште, чөнки Токсоплазма стимуллаштырылган экзозомалар иң югары таралуга китерде (мәгълүматлар күрсәтелмәгән).Бу мәгълүматларга нигезләнеп, без BV2-дән алынган Токсоплазма белән зарарланган экзозомнарның глиома күзәнәкләренең таралуында мөһим роль уйный алуын күрсәтә алабыз.
Токсоплазма белән зарарланган BV2 алынган экзозомаларның шеш үсешенә тәэсирен тикшерү өчен, без ксенографт моделе өчен ялан тычканнарга U87 глиома күзәнәкләрен салдык һәм BV2-экзозомаларын яки RH-инфекцияле BV2-экзозомаларын укол ясадык.Шешләр 1 атнадан соң ачыкланганнан соң, 5 тычканның һәр эксперимент төркеме бер үк башлангыч ноктаны билгеләр өчен шеш зурлыгына бүленде, һәм шеш зурлыгы 22 көн үлчәнде.
U87 ксенографт моделе булган тычканнарда, BV2-дән алынган RH-инфекцияле экзозома төркемендә шешнең зурлыгы һәм авырлыгы күзәтелде (3A, B рәсем).Икенче яктан, BV2-дан алынган экзозома төркеме белән экзозома белән дәваланганнан соң контроль төркем арасында шеш зурлыгында зур аерма юк иде.Моннан тыш, глиома күзәнәкләре һәм экзозомалар белән инъекцияләнгән тычканнар RH белән зарарланган BV2-экзозомалар төркемендәге иң зур шеш күләмен визуаль рәвештә күрсәттеләр (3C рәсем).Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: BV2-дән алынган Токсоплазма белән зарарланган экзозомалар тычкан шеш моделендә глиома үсешенә этәрә.
U87 ксенографт тычкан моделендә BV2 алынган экзозомнарның онкогенезы (AC).BALB / c ялангач тычканнарда шеш зурлыгы (A) һәм авырлык (B) сизелерлек артты, BV2-дән алынган RH-инфекцияле экзозомалар белән эшкәртелде.BALB / c ялангач тычканнар (C) матригель катнашмасында асылган 1 x 107 U87 күзәнәкләре белән тере астына укол ясадылар.Инъекциядән алты көн үткәч, тычканнарда 100 μг BV2 алынган экзозом эшкәртелде.Шешнең зурлыгы һәм авырлыгы күрсәтелгән көннәрдә һәм корбаннан соң үлчәнде. * П <0.05. * П <0.05. * Р <0,05. * П <0.05. * П <0.05。 * П <0.05。 * Р <0,05. * П <0.05.
Мәгълүматлар күрсәткәнчә, иммунитет яки шеш үсеше белән бәйле 37 миРНА (16 чиктән тыш кысылган һәм 21 түбән төшкән) микроглиядә Токсоплазма RH штаммы белән инфекцияләнгәннән соң сизелерлек үзгәргән (4A рәсем).Miзгәртелгән miRNAлар арасында miR-21 чагыштырма дәрәҗә дәрәҗәсе реаль вакыттагы RT-PCR белән BV2 алынган экзозомаларда, BV2 һәм U87 күзәнәкләре белән эшкәртелгән экзозомаларда расланган.MiR-21 экспрессиясе Токсоплазма гондии (RH штаммы) белән зарарланган BV2 күзәнәкләреннән экзозоматларның сизелерлек артуын күрсәтте (4Б рәсем).BV2 һәм U87 күзәнәкләрендәге miR-21 чагыштырма дәрәҗәләре үзгәртелгән экзозомалар алынганнан соң артты (4Б рәсем).Токсоплазма гондии (ME49 штаммы) белән зарарланган шеш пациентларының һәм тычканнарның ми тукымаларында miR-21 экспрессиясенең чагыштырмача дәрәҗәсе контрольгә караганда югарырак иде (4C рәсем).Бу нәтиҗәләр витрода һәм вивода фаразланган һәм расланган микроРНКларның экспрессия дәрәҗәләре арасындагы аермалар белән туры килә.
Токсоплазма гондии (RH) белән зарарланган микроглиядә экзосомаль miP-21a-5p экспрессының үзгәрүе.А) T. gondii RH инфекциясеннән соң иммунитет яки шеш үсеше белән бәйле siRNAдагы зур үзгәрешләрне күрсәтә.(B) Нисби miR-21 экспрессия дәрәҗәсе реаль вакыттагы RT-PCR белән BV2 алынган экзозомаларда, BV2 белән эшкәртелгән экзозомаларда һәм U87 күзәнәкләрендә ачыкланган.(C) Нисби miR-21 экспрессия дәрәҗәсе шеш пациентларының ми тукымаларында (N = 3) һәм Токсоплазма гондии (ME49 штаммы) белән зарарланган тычканнарда табылды (N = 3). * P <0.05 Студентларның тесты белән алынган. * P <0.05 Студентларның тесты белән алынган. * П <0,05 было получено с помощью т-критерия Стьюдента. * P <0.05 Студентларның т-тесты ярдәмендә алынган. * P <0.05 通过 学生 t 检验。。 * П <0.05 * П <0,05, полученный с помощю т-критерия Стьюдента. * П <0.05 Студентларның т-тесты ярдәмендә алынган.
RH белән зарарланган BV2 күзәнәкләреннән экзозомнар глиомаларның вивода һәм витрода үсүенә китерде (2, 3 нче рәсем).Тиешле mRNA-ны ачыклау өчен, без антимонополь максатлы геннарның mRNA дәрәҗәләрен, O1 (FoxO1), PTEN сандыкларын тикшердек, һәм BV2 яки RH BV2 экзозомалары белән зарарланган U87 күзәнәкләрендә күзәнәк үлем 4 (PDCD4).Биоинформатика анализы күрсәткәнчә, берничә шеш белән бәйле геннар, шул исәптән FoxO1, PTEN, һәм PDCD4 геннары, miR-2121,22 бәйләү урыннары бар.антимонополь максатлы геннарның mRNA дәрәҗәсе RH белән зарарланган BV2 алынган экзозомаларда BV2 алынган экзозомалар белән чагыштырганда кимеде (5A рәсем).FoxO1 RH белән зарарланган BV2 алынган экзозомаларда белок дәрәҗәсенең кимүен күрсәтте (5Б рәсем).Бу нәтиҗәләргә нигезләнеп, без раслый алабыз, RH белән зарарланган BV2-дән алынган экзозомнар анти-онкогеник геннарны регуляциялиләр, шеш үсешендә ролен саклыйлар.
Токсоплазма RH белән зарарланган BV2-экзозоматлары U87 глиома күзәнәкләрендә антитумор геннарын Токсоплазма RH белән зарарланган BV2-экзозомалар белән кысарга этәрә.(А) FoxO1, PTEN һәм PDCD4 реаль-вакыт PCR экспозициясендә Т.Гондии RH белән зарарланган BV2 ПБС экзозомалары белән чагыштырганда.control-актин mRNA контроль буларак кулланылды.(B) FoxO1 экспрессиясе Көнбатыш блотлау белән билгеләнде һәм densitometry мәгълүматлары ImageJ программасы ярдәмендә статистик бәяләнде. * P <0.05 Студентларның тесты белән алынган. * P <0.05 Студентларның тесты белән алынган. * П <0,05 было получено с помощью т-критерия Стьюдента. * P <0.05 Студентларның т-тесты ярдәмендә алынган. * P <0.05 通过 学生 t 检验。。 * П <0.05 * П <0,05, полученный с помощю т-критерия Стьюдента. * П <0.05 Студентларның т-тесты ярдәмендә алынган.
MiP-21нең шеш белән бәйле ген көйләүгә тәэсирен аңлар өчен, U87 күзәнәкләре Липофектамин 2000 ярдәмендә miP-21 ингибиторы белән күчерелде һәм күзәнәкләр трансфекциядән 24 сәгать үткәч җыеп алынды.MiR-21 ингибиторы белән күчерелгән күзәнәкләрдә FoxO1 һәм p27 экспрессия дәрәҗәләре qRT-PCR ярдәмендә BV2 алынган экзозомалар белән эшкәртелгән күзәнәкләр белән чагыштырылды (6A, B).MiR-21 ингибиторын U87 күзәнәкләренә күчерү FoxO1 һәм p27 экспрессиясен сизелерлек көйләде (FIG. 6).
RH белән зарарланган экзосомаль BV2 алынган miP-21 U87 глиома күзәнәкләрендә FoxO1 / p27 үзгәрүен үзгәртте.U87 күзәнәкләре miP-21 ингибиторы белән Липофектамин 2000 ярдәмендә күчерелде һәм трансфекциядән соң 24 сәгатьтән күзәнәкләр җыеп алынды.MiR-21 ингибиторы белән күчерелгән күзәнәкләрдәге FoxO1 һәм p27 экспрессия дәрәҗәләре qRT-PCR (A, B) ярдәмендә BV2 алынган экзозомалар белән эшкәртелгән күзәнәкләрдәге дәрәҗәләр белән чагыштырылды.
Хуҗаның иммун реакциясеннән котылу өчен, Токсоплазма паразиты тукымалар кистасына әверелә.Алар хуҗаның гомере буе төрле тукымаларны, шул исәптән ми, йөрәк, скелет мускулларын паразитлаштыралар һәм хуҗаның иммун реакциясен модульләштерәләр.Моннан тыш, алар күзәнәк циклын һәм төп күзәнәкләрнең апоптозын көйли алалар, аларның таралуына ярдәм итәләр14,24.Токсоплазма гондии күбесенчә хуҗа дендрит күзәнәкләрен, нейтрофилларны, һәм моноцит / макрофаг нәселен, шул исәптән ми микроглиясен зарарлый.Токсоплазма гондии M2 фенотибының макрофагларын дифференциацияли, патоген инфекциясеннән соң яраларны дәвалауга тәэсир итә, шулай ук ​​гиперваскуляризация һәм грануломатоз фиброз белән бәйле.Токсоплазма инфекциясенең бу үз-үзен тотыш патогенезы шеш үсеше белән бәйле маркерлар белән бәйле булырга мөмкин.Токсоплазма белән көйләнгән дошман мохит тиешле прекансерга охшарга мөмкин.Шуңа күрә, Токсоплазма инфекциясе баш ми шешләре үсешенә булышырга тиеш дип уйларга мөмкин.Чынлыкта, төрле ми шешләре булган пациентлар зарумында Токсоплазма инфекциясенең югары темплары теркәлгән.Моннан тыш, Токсоплазма гондии башка карсиноген эффектор булырга мөмкин һәм синергистик рәвештә башка йогышлы карсиногеннарга баш ми шешләрен үстерергә булышырга мөмкин.Шуңа бәйле рәвештә, P. falciparum һәм Epstein-Barr вирусы синергистик рәвештә Буркитт лимфомасы формалашуга булышалар.
Ракны тикшерү өлкәсендә регулятор буларак экзозомнарның роле киң тикшерелгән.Ләкин, паразитлар һәм зарарланган хуҗалар арасында экзозомнарның роле начар аңлашыла.Әлегә төрле регуляторлар, шул исәптән яшерен протеиннар, протозоан паразитлары хуҗа һөҗүменә каршы торалар һәм инфекцияне дәвам итәләр, биологик процессларны аңлаттылар.Күптән түгел, протозоан белән бәйле микровесикулалар һәм аларның микроРНКлары хуҗа күзәнәкләре белән үзара бәйләнештә торулары турында төшенчә барлыкка килде, аларның яшәве өчен уңайлы шартлар тудыру.Шуңа күрә үзгәртелгән экзосомаль miRNA һәм глиома күзәнәкләренең таралуы арасындагы бәйләнешне ачыклау өчен өстәмә тикшеренүләр кирәк.МикроРНА үзгәртүләре (кластер геннары miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 һәм miR-17-92) токсоплазма белән зарарланган кеше макрофагларында STAT3 промоутеры белән бәйләнә, көйләнә һәм анти-анти. - Токсоплазма гондии инфекциясенә җавап итеп 29.Токсоплазма инфекциясе miR-17-5p һәм miR-106b-5p тәэсирен арттыра, алар берничә гиперпролифератив авырулар белән бәйле 30.Бу мәгълүматлар Токсоплазма инфекциясе белән көйләнгән miRNA-ның паразитларның яшәве һәм хуҗа биологик тәртибендә патогенез өчен мөһим молекулалар булуын күрсәтәләр.
Miзгәртелгән miRNA-лар зарарлы күзәнәкләр башлану һәм алга китү вакытында төрле тәртипкә тәэсир итә ала, шул исәптән глиомалар: үсеш сигналларының үз-үзен тәэмин итүе, үсешне тыя торган сигналларга сизгерлек, апоптоздан качу, чикләнмәгән реплика потенциалы, ангиогенез, инвазия һәм метастаз, һәм ялкынсыну.Глиомада үзгәртелгән miRNA берничә профильле тикшеренүләрдә ачыкланган.
Хәзерге тикшеренүдә без токсоплазма белән зарарланган күзәнәкләрдә miRNA-21 экспрессиясенең югары дәрәҗәсен расладык.miR-21 каты шешләрдә иң еш очрый торган микроРНКларның берсе дип билгеләнде, шул исәптән глиома, 33 һәм аның чагылышы глиома дәрәҗәсе белән туры килә.Evidenceыелган дәлилләр шуны күрсәтә: miR-21 - глиома үсешендә анти-апоптотик фактор булып эшләгән һәм кеше миенең яман шеш тукымаларында һәм плазмасында чиктән тыш кысылган роман онкоген.Кызык, глиома күзәнәкләрендә һәм тукымаларда miR-21 инактивлашуы каспазга бәйле апоптоз аркасында күзәнәкләр таралуны тыя.MiR-21 фаразланган максатларга биоинформатик анализ апоптоз юллары белән бәйле берничә шешне басучы генны ачыклады, шул исәптән программаланган күзәнәк үлеме 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN, һәм O1 (FoxO1) тартмасы, miR-2121 бәйләү урыны..22.38.
FoxO1, транскрипция факторларының берсе буларак, кеше яман шешенең төрле төрләрен үстерүдә катнаша һәм p21, p27, Bim, FasL40 кебек шешне басучы геннарның чагылышын көйли ала.FoxO1 күзәнәк үсешен басу өчен p27 кебек күзәнәк циклы ингибиторларын бәйли һәм активлаштыра ала.Моннан тыш, FoxO1 PI3K / Акт сигнализациясенең төп эффекторы һәм p2742 транскрипциясен активлаштыру аша күзәнәк циклы үсеше һәм күзәнәк дифференциациясе кебек күп биологик процессларны көйли.
Ахырда, без Токсоплазма белән зарарланган микроглиядән алынган экзосомаль miR-21 глиома күзәнәкләренең үсеш көйләүчесе буларак мөһим роль уйный ала дип саныйбыз (7 нче рәсем).Ләкин, экзосомаль miR-21, үзгәртелгән Токсоплазма инфекциясе һәм глиома үсеше арасында туры бәйләнеш табу өчен, алга таба тикшеренүләр кирәк.Бу нәтиҗәләр Токсоплазма инфекциясе һәм глиома очраклары арасындагы бәйләнешне өйрәнү өчен башлангыч нокта булыр дип көтелә.
Бу тикшеренүдә глиома (ми) карсиногенез механизмының схематик схемасы тәкъдим ителә.Автор PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA) сыза.
Бу тикшеренүдә барлык эксперименталь протоколлар, шул исәптән хайваннарны куллану, Сеул Милли Университетының Хайваннарны карау һәм кулланучылар комитеты стандарт этик принципларына туры килде һәм Сеул Милли Университеты Медицина Мәктәбенең Институциональ күзәтү советы тарафыннан расланды (SNB- SNU- 150715).-2).Барлык эксперименталь процедуралар да ARRIVE тәкъдимнәре нигезендә башкарылды.
BV2 тычкан микроглиясе һәм U87 кеше глиомасы күзәнәкләре Дулбекконың Модификацияләнгән Бөркет уртачасында (DMEM; Велген, Сеул, Корея) һәм Росвелл Парк Мемориал Институтының Урта (RPMI; Велген) культурасында культуралы булганнар, һәрберсендә 10% фетал бовины серумы, 4 мм л- глютамин, 0,2 мм пенициллин һәм 0,05 мм стрептомицин.Күзәнәкләр 37 ° C температурада 5% CO2 булган инкубаторда культураланган.Тагын бер глиома күзәнәк линиясе, U118, U87 күзәнәкләре белән чагыштыру өчен кулланылды.
Экзозомнарны Т.Гондии белән зарарланган RH һәм ME49 штаммнарыннан аеру өчен, Т.Гондий тачизоитлары (RH штаммы) 3 атналык инъекцияләнгән 6 атналык BALB / c тычканнарның карын куышлыгыннан җыелган.Тачизоитлар ПБС белән өч тапкыр юылганнар һәм центрифугация белән 40% Перколлда чистартылган (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, МО, АКШ) 43.ME49 штаммының тачизоитларын алу өчен, BALB / c тычканнары 20 тукыма кисты белән интерперитональ рәвештә инъекцияләнделәр, һәм кисталарда тахизоит трансформациясе инфекциядән соң 6-8 нче көнне карын куышын юып җыелдылар.ПБС белән зарарланган тычканнар.ME49 тачизоитлар 100 μг / мл пенициллин (Гибко / БРЛ, Гранд Айленд, Нью-Йорк, АКШ), 100 μг / мл стрептомицин (Gibco / BRL), һәм 5% фетал бовины серумы (Лонза, Волкерсвилл, МД) белән тулыландырылган күзәнәкләрдә үстерелде. .., АКШ) 37 ° C һәм 5% углерод газы.Веро күзәнәкләрендә эшкәртелгәннән соң, ME49 тачизоитлар 25 үлчәүле энә аша, аннары чүп һәм күзәнәкләрне чыгару өчен 5 мм фильтр аша үттеләр.Hingынганнан соң, тачизоитлар PBS44 реанимациясендә.Токсопласма гондии штаммының тукымалы кисталары зарарланган C57BL / 6 тычканнар миеннән изоляцияләнгән кистларның интерперитональ инъекциясе белән сакланган (Көнчыгыш Био Хайваннар Centerзәге, Сонгнам, Корея).ME49 зарарлы тычканнарның миләре 3 айлык PIдан соң җыелганнар һәм кистларны изоляцияләү өчен микроскоп астында кысылганнар.Йогышлы тычканнар Сеул Милли Университеты Медицина мәктәбендә махсус патогенсыз шартларда сакланган.
Тулаем РНА җитештерүче күрсәтмәләре буенча, шул исәптән элитация адымы өчен инкубация вакытын да кертеп, miRNeasy Mini Kit (Киаген, Хилден, Германия) ярдәмендә BV2 алынган экзозомалардан, BV2 күзәнәкләреннән һәм тукымалардан алынган.РНК концентрациясе NanoDrop 2000 спектропотометрында билгеләнде.РНК микроаррейларының сыйфаты Agilent 2100 биоанализеры ярдәмендә бәяләнде (Agilent Technologies, Amstelveen, Нидерланд).
10% экзозом-ярлы FBS булган DMEM ультрацентрификация белән 100гг 16 сәгать эчендә 4 ° C ка әзерләнгән һәм 0,22 мм фильтр аша фильтрланган (Нальген, Рочестер, Нью-Йорк, АКШ).BV2 күзәнәкләре, 5 × 105, DMEMда 10% экзозома-тузган FBS һәм 1% антибиотиклар 37 ° C һәм 5% CO2 булган.24 сәг.BV2 күзәнәкләреннән алынган экзозомнар иң киң кулланылган ысул үзгәртелгән дифференциаль центрифугация белән изоляцияләнде.Экзозом пелетны РНК яки протеин анализы өчен 300 µл ПБСта торгызыгыз.Изоляцияләнгән экзозоматларның концентрациясе BCA протеин анализлау комплекты (Пирс, Рокфорд, IL, АКШ) һәм NanoDrop 2000 спектропотометры ярдәмендә билгеләнде.
BV2 күзәнәкләреннән явым-төшемнәр яки BV2-дән алынган экзозоматлар PRO-PREP ™ белок чыгару эремәсендә (iNtRon Биотехнология, Сонгнам, Корея) лизизацияләнгәннәр һәм аксымнар Coomassie өстенә зәңгәр төсле 10% SDS полиакриламид гельләренә салынган.Моннан тыш, протеиннар PVDF мембраналарына 2 сәгать күчерелде.Көнбатыш блоклары Alix антителасы ярдәмендә расланган (күзәнәк сигнал технологиясе, Беверли, MA, АКШ) экзосомаль маркер буларак.Тычканга каршы HRP-конфигурацияләнгән кәҗә IgG (H + L) (Бетил Лабораторияләре, Монтгомери, Тех, АКШ) һәм LAS-1000 плюс люминесцент сурәт анализаторы (Фужи Фотографик Фильмы, Токио, Япония) икенчел антитела буларак кулланылды..Электрон микроскопия тапшыру экзозомаларның зурлыгын һәм морфологиясен өйрәнү өчен башкарылды.BV2 күзәнәкләреннән изоляцияләнгән экзозоматлар (6,40 µг / µл) углерод белән капланган мешларда әзерләнгәннәр һәм 1 минутка 2% уранил asetat белән тискәре буялган.Әзерләнгән үрнәкләр ES1000W Erlangshen CCD камерасы белән җиһазландырылган JEOL 1200-EX II (Токио, Япония) ярдәмендә 80 кВ тизләнүче көчәнештә күзәтелде (Гатан, Плеасантон, Калифорния, АКШ).
BV2-дан алынган экзозомалар PKH26 Кызыл флуоресцент бәйләүче комплекты (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, МО, АКШ) бүлмә температурасында 15 минутка буялган.U87 күзәнәкләре, 2 × 105, PKH26 маркалы экзозомалар (кызыл) яки тискәре контроль буларак экзозомалар юк, 37 ° C тәүлек эчендә 5% CO2 инкубаторында инкубацияләнделәр.U87 күзәнәк ядрәләре DAPI (зәңгәр) белән буялган, U87 күзәнәкләре 4% параформалдегидта 15 минутта 4 ° C ка торгызылды, аннары Leica TCS SP8 STED CW конфокаль микроскоп системасында анализланды (Leica Microsystems, Mannheim, Германия).күзәтелә.
cDNA siRNAдан Mir-X siRNA синтезы һәм SYBR qRT-PCR комплекты ярдәмендә синтезланган (Takara Bio Inc., Shiga, Япония).Реаль вакыт санлы PCR iQ5 реаль вакыт PCR ачыклау системасы (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, АКШ) SYBR Premix белән кушылган праймерлар һәм шаблоннар ярдәмендә башкарылды.ДНК 40 циклда денатурация өчен 95 ° C, 15 с өчен 60 ° C һәм 60 с.PCR реакциясеннән алынган мәгълүматлар iQ ™ 5 оптик система программасының (Bio-Rad) мәгълүмат анализлау модуле ярдәмендә анализланды.Сайланган максатлы геннар һәм β-актин / siRNA (һәм U6) арасында ген экспрессиясендә чагыштырма үзгәрешләр стандарт сызык ысулы ярдәмендә исәпләнде.Кулланылган праймер эзлеклелеге 1 нче таблицада күрсәтелгән.
3 x 104 U87 глиома күзәнәкләре 96 кое тәлинкәләргә чәчелгәннәр һәм 12, 18 һәм 36 сәгатьтә контроль буларак BV2 (50 μg / mL) яки BV2 (50 μg / mL) алынган Токсоплазма белән зарарланган экзозомалар белән кушылганнар. .Күзәнәкләрнең таралу дәрәҗәсе күзәнәкләрне санау комплекты-8 (Дожиндо, Кумамото, Япония) ярдәмендә билгеләнде (S1-S3 өстәмә рәсемнәр) 46.
5 атналык хатын-кыз BALB / c ялангач тычканнар Ориент Биодан (Сонгнам-Си, Көньяк Корея) сатып алынганнар һәм бүлмә температурасында (22 ± 2 ° C) һәм дымлылыкта (45 ± 15 ° C) стериль кафеларда аерым сакланганнар.%) бүлмә температурасында (22 ± 2 ° C) һәм дымлылыкта (45 ± 15%).SPF (Сеул Милли Университеты Медицина Хайваннар Centerзәге) кысаларында 12 сәгатьлек яктылык циклы һәм 12 сәгатьлек караңгы цикл башкарылды.Тычканнар очраклы рәвештә 5 тычканның өч төркеменә бүленде һәм барлык төркемнәргә дә 1 мл 107 U87 глиома күзәнәкләре булган 400 мл ПБС белән инъекция ясалды һәм BD Matrigel ™ үсеш факторы кимеде (BD Science, Miami, FL, АКШ).Шиш инъекциясеннән алты көн үткәч, BV2 күзәнәкләреннән алынган 200 мг экзозома (Токсоплазма инфекциясе белән) шеш урынына укол салдылар.Шеш инфекциясеннән егерме ике көн үткәч, һәр төркемдәге тычканнарның шеш зурлыгы атнага өч тапкыр калипер белән үлчәнде, һәм шеш күләме формула белән исәпләнде: 0,5 × (киңлек) × 2 × озынлык.
MiRCURYTM LNA miRNA массивы ярдәмендә MicroRNA анализы, 7 нче буын, mmu һәм rno массивлары бар (EXIQON, Ведбаек, Дания) 3100 кеше, тычкан һәм тычкан miRNA тоту зоналары арасында 1119 яхшы характерлы тычканны үз эченә ала.Бу процедура барышында 250-1000 нг гомуми РНК 5′-фосфаттан бозау эчәк эшкәртүле фосфатаза белән эшкәртелде, аннары Hy3 яшел флуоресцент буяу белән тамгаланды.Аннары маркировкаланган үрнәкләр гибридизация камерасы комплекты (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, АКШ) һәм гибридизация слайд комплекты (Agilent Technologies) ярдәмендә микроаррей слайдларны йөкләп гибридлаштырылды.Гибридизация 16 сәгать 56 ° C температурада үткәрелде, аннары микроаррейлар җитештерүче тәкъдимнәре буенча юылды.Эшкәртелгән микроаррей слайдлар аннары Agilent G2565CA микроаррей сканер системасы ярдәмендә сканерланды (Agilent Technologies).Сканерланган рәсемнәр Agilent Feature Extraction программа версиясе 10.7.3.1 (Agilent Technologies) ярдәмендә кертелде һәм үзгәртелгән Exiqon протоколының GAL файллары ярдәмендә һәр рәсемнең флюоресенция интенсивлыгы бәяләнде.Агымдагы өйрәнү өчен микроаррей мәгълүматлар GEO мәгълүмат базасында GPL32397 кушылу номеры астында урнаштырылган.
Токсоплазма белән зарарланган RH яки ME49 штаммнарындагы җитлеккән экзосомаль miRNAларның экспресс профильләре төрле челтәр кораллары ярдәмендә анализланды.шеш үсеше белән бәйле miRNAs miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) ярдәмендә ачыкланды һәм нормальләштерелгән сигнал интенсивлыгы белән чистартылды (log2) 8.0-тан зуррак.MiRNA-лар арасында дифференциаль рәвештә күрсәтелгән miRNA-лар Т.Гондии белән зарарланган RH яки ME49 штаммнары үзгәртелгән miRNA-ның фильтр анализы белән 1,5 тапкырга күбрәк үзгәртелгән.
Күзәнәкләр алты кое тәлинкәгә (3 х 105 күзәнәк / кое) опти-MEM (Гибко, Карлсбад, Калифорния, АКШ) Липофектамин 2000 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния, АКШ) ярдәмендә чәчелгән.Күчерелгән күзәнәкләр 6 сәгать культуралы булдылар, аннары уртача яңа тулы уртага үзгәртелде.Күзәнәкләр трансфекциядән 24 сәгать үткәч җыелган.
Статистика анализы, нигездә, Excel программа тәэминаты (Microsoft, Washington, DC, АКШ) белән Студентларның тестын кулланып башкарылды.Эксперименталь хайваннар анализы өчен, Prism 3.0 программа ярдәмендә ике яклы ANOVA башкарылды (GraphPad Software, La Jolla, CA, АКШ). P-кыйммәтләре <0.05 статистик яктан мөһим дип саналды. P-кыйммәтләре <0.05 статистик яктан мөһим дип саналды. Значения П <0,05 считались статистически значимыми. P кыйммәтләре <0.05 статистик яктан әһәмиятле саналды. P 值 <0.05 被 认为 具有 统计学。。 П 值 <0.05 Значения П <0,05 считались статистически значимыми. P кыйммәтләре <0.05 статистик яктан әһәмиятле саналды.
Бу тикшеренүдә кулланылган барлык эксперименталь протоколлар Сеул Милли Университет Медицина Мәктәбенең Институциональ күзәтү советы тарафыннан расланды (IRB номеры SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Фурли, Дж. Һ.б.2018-нче елда глобаль яман шеш авыруы һәм үлү очраклары: ГЛОБОКАН чыганаклары һәм ысуллары.Тәрҗемә итү.Дж. Рак 144, 1941–1953 (2019).
Рашид, С., Рехман, К. & Акаш, М.С. Баш ми шешләренең куркыныч факторларын һәм аларның терапевтик интервенцияләрен аңлау. Рашид, С., Рехман, К. & Акаш, М.С. Баш ми шешләренең куркыныч факторларын һәм аларның терапевтик интервенцияләрен аңлау.Рәшит, С., Рехман, К. һәм Акаш, М.С. Баш ми шешләре һәм төп терапевтик интервенцияләр өчен куркыныч факторларга күзәтү. Рәшит, С., Рехман, К. & Акаш, МС 深入 了解 脑 肿瘤。。。 Рашид, С., Рехман, К. & Акаш, М.С. Баш ми шешенең куркыныч факторларын һәм терапевтик чараларны тирәнтен аңлау.Рәшит, С., Рехман, К. һәм Акаш, М.С. Баш ми шешләре һәм төп терапевтик интервенцияләр өчен куркыныч факторларга күзәтү.Биомедицина фәннәре.Фармацевт.143, 112119 (2021).
Като, И., Чжан, Дж. & Кояш, Дж. Като, И., Чжан, Дж. & Кояш, Дж.Като И, Чжан Дж. Като, И., Чжан, Дж. & Кояш, Дж. 人类 细菌 细菌 细菌 细菌 - 病毒 病毒 病毒 细菌 Като, И., Чжан, Дж. & Кояш, Дж.Като И, Чжан Дж һәм Кояш Дж. Кеше ашказаны-эчәк яман шеш авыруындагы бактерия-вируслы үзара бәйләнеш: эпидемиологик һәм лаборатория мәгълүматлары.Рак 14, 425 (2022).
Магон, KL & Parish, JL Инфекциядән ракка кадәр: ДНК шеш вируслары үзәк күзәнәк углеродын һәм липид метаболизмын ничек үзгәртә. Магон, KL & Parish, JL Инфекциядән ракка кадәр: ДНК шеш вируслары үзәк күзәнәк углеродын һәм липид метаболизмын ничек үзгәртә.Махон, К.Л. Магон, KL & Parish, JL 从 ： ： ： DNA 肿瘤 ： ： ：。。。。 Магон, KL & Parish, JL Инфекциядән ракка кадәр: ДНК шеш вируслары үзәк күзәнәк углеродын һәм липид метаболизмын ничек үзгәртә.Махон, К.Л.Ачык биология.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM һ.б.Шистосомаларның катехол эстрогеннары һәм бавыр флюклары һәм гельминт белән бәйле яман шеш.фронт.эчтә кайнар.5, 444 (2014).